научная статья по теме СОСТОЯНИЕ ЛИПАЗ ГРИБОВ RHIZOPUS MICROSPORUS, PENICILLIUM SP. И OOSPORA LACTIS В ПРИГРАНИЧНЫХ СЛОЯХ ВОДА–ТВЕРДАЯ ФАЗА; ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ Химия

Текст научной статьи на тему «СОСТОЯНИЕ ЛИПАЗ ГРИБОВ RHIZOPUS MICROSPORUS, PENICILLIUM SP. И OOSPORA LACTIS В ПРИГРАНИЧНЫХ СЛОЯХ ВОДА–ТВЕРДАЯ ФАЗА; ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ»

ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 5, с. 511-519

УДК 577.152.2

СОСТОЯНИЕ ЛИПАЗ ГРИБОВ Rhizopus microsporus, Pénicillium sp. И Oospora lactis В ПРИГРАНИЧНЫХ СЛОЯХ ВОДА-ТВЕРДАЯ ФАЗА; ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ

© 2015 г. Х. Т. Хасанов, К. Давранов, М. М. Рахимов

Национальный университет Узбекистана им. Мирзо Улугбека,Ташкент, 100174

e-mail: k_davranov@mail.ru Поступила в редакцию 26.02.2015 г.

Показано, что в модельных системах вода—липид и вода—твердая фаза изменение каталитической активности липаз, синтезируемых грибами Rhizopus microsporus, Pénicillium sp. и Oospora lactis, и их способность адсорбироваться на различных сорбентах зависели от природы групп, находящихся на поверхности твердой фазы. Так, в присутствии сорсилена или ДЭАЭ-целлюлозы увеличивалась стабильность липаз гриба Pénicillium sp., при этом сохранялось 85 и 55% их исходной активности соответственно. В присутствии силикагеля и КМ-целлюлозы наблюдалось снижение скорости гидролиза липидов ферментами Pénicillium sp. в водной среде, а аминоаэросила и поликефамида глубина их гидролиза повышалась в 2.4 и 1.5 раза соответственно. В водно-спиртовой среде аминоаэросил и поликефамид снижали скорость гидролиза субстрата более чем в 30 раз. Введение аэросила как в водную, так в водно-спиртовую среду приводило к повышению глубины гидролиза в 1.2—1.3 раза. Сорсилен оказывал стабилизирующее действие на липазу Pénicillium sp. при 40, 45, 50 и 55°C. В зависимости от рН среды и природы химических групп, локализованных на поверхности твердой фазы, наблюдалась либо стабилизация, либо инактивация липаз, при этом изменялась и их синтетаз-ная активность.

Ключевые слова: липазы, Rhizopus microsporus, Pénicillium sp., Oospora lactis, хлопковое масло, рыбий жир.

Б01: 10.7868/80555109915050128

Липазы (КФ 3.1.1.3) катализируют реакции гидролиза и синтеза эфиров глицерина с длинноце-почными жирными кислотами [1]. Активно катализируя реакции разложения триглицеридов до ди-, моноглицеридов, глицерина и жирных кислот в водной среде, липазы в системах с низким содержанием воды катализируют обратную реакцию синтеза эфиров глицерина с жирными кислотами и ряд других реакции [1, 2].

Липазы широко применяются в различных биотехнологических процессах [3]. Так, липазы, обладающие энантиоселективностью, используются при получении оптически чистых изомеров, а также в качестве биокатализаторов в органическом синтезе [1, 4, 5].

В настоящее время ряд липаз выделен в гомогенном состоянии и определены их аминокислотные последовательности, трехмерная структура и другие структурные элементы, а также получены их кристаллы. Это позволяет целенаправленно осуществлять микробиологический синтез этих ферментов с заданными свойствами [6—8]. Действительно, большинство липаз, имеющих прак-

тическое применение, получены путем микробиологического синтеза [1, 3, 9].

В отличие от многих гидролаз, липаза обладает чрезвычайно широкой субстратной специфичностью. Многие из них активны и стабильны в системе с органическими растворителями. Тем не менее, широкому их применению в крупных технологических процессах препятствуют ограниченная стабильность этих ферментов и невозможность их многократного использования. Вследствие того, что процесс липолиза протекает в гетерогенных системах, его скорость в ряде случаев может значительно снижаться [10].

Разработанные в настоящее время различные способы стабилизации ферментов, не всегда дают положительные результаты в случае липолитиче-ских ферментов. Так, например, ковалентная иммобилизация липаз на нерастворимых носителях, хотя и приводила к значительному повышению их стабильности, но сопровождалась резким снижением активности в основном вследствие того, что субстраты липаз не растворимы в воде. Доступ нерастворимого субстрата к иммобилизо-

ванной липазе затруднялся, что и приводило к снижению активности фермента [11].

Липазы грибов Rhizopus microspores, Penicillium sp. и Oospora lactis получены в гомогенном состоянии и охарактеризованы [6]. Показано, что особенностью этих липаз является нестабильность. Известно, что использование систем, включающих твердые фазы позволяет повышать стабильность некоторых ферментов и регулировать их каталитические свойства [12, 13]. Это достигается путем введения определенных твердых сорбентов в реакционную среду, в которой протекает ферментативная реакция. В основном, выбор твердой фазы и условий повышения активности ферментов в таких системах, осуществляется чисто эмпирическим путем.

Цель работы — сравнительное изучение действия липаз грибов R microsporus УзЛТ-1, Penicillium sp. и O. lactis УзЛМ-2 в системах с твердыми фазами.

МЕТОДИКА

Реагенты. Для приготовления буферных растворов использовали уксусную кислоту, фосфорную кислоту, орто-борную кислоту, едкий натрий, одно- и двухзамещенный фосфорнокислый калий — все категории х. ч.

В качестве твердых фаз использовали силика-гель, ДЭАЭ-целлюлозу, КМ-целлюлозу ("Реа-хим", Россия), аэросил и аминоаэросил (Институт физической химии, Украина) и сорсилен (сополимер терефталевой кислоты с этиленгликолем, Высшая технологическая школа, Чехия). ДЭАЭ- и КМ-целлюлозу (ДЭАЭЦ, КМЦ) обрабатывали последовательно 0.5 н HCl и 0.5 н NaOH и промывали дистиллированной водой до нейтрального значения рН. Целлюлозы уравновешивали 0.1 М универсальным буфером до значений рН, соответствующих рН-оптимуму действия фермента. Суспензии сорбентов в 0.1 М универсальном буфере с соответствующими рН смешивали с раствором фермента и определяли его активность.

Ферменты и их очистка. В работе использовали препараты гомогенных липаз с удельной активностью 14080, 13 500 и 12600 ед./г из грибов R. microsporus, O. lactis, Penicillium sp. (Институт микробиологии АН Республики Узбекистан) соответственно, очищенные согласно ранее опубликованной методике [6].

Определение липолитической активности. Ли-

политическую активность оценивали фотоколориметрическим методом с использованием в качестве хромофорного агента родамина 6Ж [14]. За единицу активности принимали количество (мкмоль) жирных кислот, образующихся за 1 мин реакции в расчете на 1 мг белка.

В качестве субстрата использовали рафинированные хлопковое масло и рыбий жир из сардин иваси (Sardinops sagax melanosticta), эмульгированный в равном объеме 1%-ного раствора поливинилового спирта. Реакционную смесь (2 мл), состоящую из 0.2 мл субстрата в 0.1 М фосфатном буфере, рН 7.5, содержащем 20 мМ СаС12, и 0.01 мг фермента, инкубировали в течение 1 ч при 37°C. В различных вариантах опыта в реакционной среде присутствовало 20 мг/мл сорбента. Реакцию останавливали добавлением 1 мл 0.1 М НС1 в этаноле к 0.25 мл реакционной смеси. Остальные операции проводили как описано в методике [14].

Синтез сорбентов для иммобилизации липоли-тичских ферментов. К 100 г SiO2 с размером частиц 160—250 мкм добавляли 10 г полиамида, растворенного в концентрированной НС1 (200 мл). Смесь инкубировали при перемешивании в течение 1.5—2.0 ч, затем добавляли 200 мл 40%-ного водного ацетона. Надосадочную жидкость декантировали, а сорбент промывали дистиллированной водой до нейтрального значения рН. Полученный сорбент активировали 2 н. НС1 в течение 1.5—2.0 ч при 45°C, промывали дистиллированной водой и модифицировали 1%-ным раствором глутарового диальдегида в 0.1 М фосфатном буфере рН 8.0 в течение 2 ч.

Не связавшийся глутаровый диальдегид удаляли промыванием дистиллированной водой и 0.1 М фосфатным буфером рН 8.0. Затем к сорбенту добавляли раствор 40 мг/мл кефалина (фосфотиди-лэтаноламина) в 0.1 М буфере рН 8.0, содержащим 50% этилового спирта. Смесь инкубировали при постоянном перемешивании в течение 24 ч, промывали этанолом и высушивали на воздухе [15].

Иммобилизацию липаз на сорбенте проводили при инкубации 100 мл раствора фермента в 0.1 М фосфатном буфере, рН 7.4—8.0, с носителем в течение 3—5 ч при 4—10°C. Соотношение носителя (полиамида) и фермента составляло 10 : 1. Несвя-завщийся с сорбентом фермент удаляли промыванием 0.1 М фосфатным буфером, рН 8.0.

Получение сорсилена с липидным покрытием. К 1 г сорсилена добавляли 20 мл диэтилового эфира, содержащего 25 мг/мл хлопкового масла. После перемешивания диэтиловый эфир упаривали на роторном испарителе. К полученному сорбенту добавляли 20 мл 0.1 М универсального буфера с различными рН и суспендировали.

Измерение термостабильности липаз. Термостабильность липаз определяли в 0.1 М фосфатном буфере при различной температуре и рН. Активность фермента определяли при 37°C. В различных вариантах опыта в инкубационной среде содержалось 20 мг/мл сорбента.

Анализ продуктов ферментации липидов в водно-органических средах. Для анализа продуктов ферментации липидов использовали высокоэф-

Таблица 1. Ферментативный гидролиз липазами эмульгированных липидов в системах с твердыми фазами в водной и водно-спиртовой средах

Скорость гидролиза, мкмоль/ч

Вид сорбента R. microsporus O. lactis Pénicillium sp.

водная среда водно-спиртовая среда (30 об. %) водная среда водно-спиртовая среда (10 об. %) водная среда водно-спиртовая среда (10 об. %)

Без сорбента Аэросил Силикагель Поликефамид Аминоаэросил Сорсилен 6.4 ± 0.3 4.9 ± 0.1 18.4 ± 0.2 1.3 ± 0.005 8.6 ± 0.15 13.2 ± 0.1 0.62 ± 0.02 0.6 ± 0.02 2.4 ± 0.07 0.06 ± 0.01 0.3 ± 0.02 1.2 ± 0.04 6.2 ± 0.2 7.0 ± 0.2 3.6 ± 0.1 0.6 ± 0.25 7.2 ± 0.2 12.2 ± 0.06 2.48 ± 0.1 2.8 ± 0.1 1.6 ± 0.05 0.01 ± 0.001 0.032 ± 0.002 4.1 ± 0.1 3.2 ± 0.15 2.6 ± 0.1 3.6 ± 0.2 0.5 ± 0.02 4.2 ± 0.2 2.7 ± 0.1 2.2 ± 0.1 1.2 ± 0.06 1.4 ± 0.05 0.02 ± 0.01 0.5 ± 0.02 2.4 ± 0.01

фективную микротонкослойную хроматографию на микропластинках с силикагелем КСКГ с размером частиц 5—10 мкм («Реахим», Россия) и сили-казолем в качестве связующего агента [16]. На стеклянные микропластинки (6 х 6 или 6 х 9 см), наносили суспензию силикагеля с золем и активировали в течение 15 мин при 110°C. Продукты гидролиза липидов в гексане наносили на микропластинки. Хроматографию проводили в системе гексан—ди-этиловый эфир—уксусная кислота (80 : 20 : 1).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для оценки эффектив

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком