БИОФИЗИКА, 2013, том 58, вып. 1, с. 106-116
БИОФИЗИКА СЛОЖНЫХ СИСТЕМ
УДК 577.352; 577.15
СО СТОЯНИЕ СУКЦИНАТДЕГИДР ОГЕНАЗЫ В О P ГАНИЗМЕ -«ВЫВЕДЕННОЕ ИЗ РАВНОВЕСИЯ» ИЛИ ГИПЕРАКТИВНОЕ
© 2013 г. М.Н. Кондрашова, М.В. Захарченко, Н.В. Хундерякова, Н.И. Федотчева,
Е.Г. Литвинова, О.И. Романова, А.А. Гуляев
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, ПущиноМосковской области, ул. Институтская, 3 E-mail: mkondrashova23@inbox.ru Поступила в p едакцию 20.11.12 г.
Благодаря использованию оригинального цитобиохимического метода изучения процессов окисления в митохондриях при сохранении их нативной организации в сеть внутри лимфоцитов в мазке крови обнаружено состояние гиперактивации сукцинатдегидрогеназы, реализующееся в организме при возбуждении. Оно соответствует представлению о неравновесном состоянии ферментов при активности. Механизм сдерживания гиперактивности сукцинатдегидрогеназы основан на полноценном функционировании а-кетоглутаратдегидрогеназы, поддерживаемой окислением изолимонной кислоты.
Ключевые слова: сукцинатдегидрогеназа, митохондрии, лимфоциты, адаптация, стресс, цито-х имия.
Исследования энергетических процессов митохондрий обычно относят к области биохимии. Хотя деление близких разделов физико-химической биологии довольно условно, тем не менее можно выделить основные особенности идеологии исследователей, по которым проводится это деление. Так, биохимики это - биологи, более склонные к химии, а биофизики, несомненно, лучше ощущают значимость физической организации живой материи, которую они изучают. Противопоставление - физики и химики - не менее значительно, чем - физики и лирики. Химия - это растворы, физика - структуры.
Конечно, в исследуемом объекте эти сторо -ны составляют единое целое. Но дело в том, что пр и исследовании человек оперирует умственным представлением об объекте (мыслеоб-разом), т.е. в зависимости от своих склонностей и способностей выделяет те или иные отдельные черты объекта. Говоря слова «митохондрия, гомогенат, стресс» или какое-то другое, казалось бы, вполне определенное наименование, разные люди вкладывают в него часто очень
Сокращения: СДГ - сукцинатдегидрогеназа, ЩУК - ща-велевоуксусная кислота, АДР - адреналин, ЦБХ - цито-биохимический, ЯНТ - янтарная кислота, ГЛУ - глута-миновая кислота, ИЗЛ - изолимонная кислота, МАЛ -малонат, КДГ - а-кетоглутаратдегидрогеназа, КГЛ - а-кетоглутаровая кислота, МДА - малоновый диальдегид, МФ - моноформазан, ДФ - диформазан, АФК - активные формы кислорода, НСТ - нитросиний тетразолий.
различное содержание. Для плодотворного исследования очень важно не тер ять связь между реальным объектом и его мыслеобразом. Для визуализации объекта важна его р еальная физическая организация, которая сильно зависит от условий работы с препаратом. Лев Александрович Блюменфельд много дал научному сообществу для реального проникновения представлений о физическом устройстве исследуемого объекта в его биохимическое изучение. Эти идеи, пр онизывающие его собственные ра -боты, преподнесены в систематическом изложении в его нескольких руководствах по биофизике [1,2].
В предлагаемой статье пр иводится пример плодотворности объединения биофизического и биохимического подходов в исследовании митохондрий для развития нового метода их изучения. При этом мы отметим те из наших результатов, которые особенно созвучны идеям Л.А. Блюменфельда.
НЕУДОВЛЕТВОРЕННОСТЬ ТРАДИЦИОННЫМ БИОХИМИЧЕСКИМ МЕТОДОМ ИССЛЕДОВАНИЯ МИТОХОНДРИЙ
Первый автор данной работы застал еще в 50-е годы пр ошлого века пер иод перехода от совсем старинных методов изучения окислительных процессов, на которых, однако, ос-
нованы представления таких классиков, как Варбур г, К реб с, и всего сообщества биохимиков, следовавших за ними, к современным исследованиям. Первоначально исследования про -водили на грубо поврежденных гомогенатах, где митохондрии соседствовали с обрывками клеток. Измерения длились десятками минут или даже часами. Начальные 20-30 мин инкубации выпадали из измер ений ввиду необходимости выр авнивать температуру. На таком фоне огромным приближением к физиологическим условиям было выделение митохондрий, отмытых от разр ушенной ткани, разработанное Ле-нинджером и другими, в сочетании с введенным Чансом полярографическим методом, позволяющим регистр ир овать дыхание в течение минут или секунд. Эти препараты и различные быстрорегистрирующие методы исследования позволили открыть молекулярные механизмы трансформации энергии и их регуляцию определенными веществами. После того как внут-римитохондриальные механизмы были детально расшифрованы, появилось стремление связать их работу с физиологическими ответами организма. Эта область даже получила наименование «митохондр иальной физиологии», со -кращенно MiP. В ней можно выделить два направления. Одно, которое четко выявляет действие на митохондриальные процессы различных регуляторов, добавляемых in vitro к митохондриям или клеткам. Эти исследования раскрыли многие регулято рные механизмы физиологических функций. Другое направление ориентировано на исследование вне организма ответов митохондрий, вызванных воздействиями внутри организма. Оказалось, что продвижение на этом пути значительно медленнее. Если добавление, например, универсальных активаторов, ионов кальция или адреналина (АДР) к выделенным митохондриям давало выраженные эффекты, то после их введения в организм наблюдающиеся ответы были выражены гор аздо слабее. Втор ое направление является очень важным для медицинских исследований, поскольку не только для биохимии, но и для фундаментальной медицины стала ясной ключевая роль митохондрий в состоянии организма. Поэтому возник все возрастающий запрос к методам, которые могут определить состояние митохондрий у пациента. Являясь также приверженцами этого направления, мы много лет посвятили попыткам выявить на выделенных митохондриях реакции, соответствующие физиологическим изменениям в организме. В результате мы пришли к выводу, который очень трудно было сделать, что сама широко используемая процедура выделения митохонд-
рий, котор ая направлена на разрушение основного механизма, регулирующего физиологические реакции органелл, должна быть исключена [3,4].
НЕОБХОДИМ ОС ТЬ С ОХРАНЕНИЯ in vitro
БИОФИЗИЧЕСКОЙ ОРГАНИЗАЦИИ МИТОХОНДРИЙ in vivo ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ИХ РЕГУЛЯЦИИ В ОРГАНИЗМЕ
Митохондрии в клетке существуют в форме объединяющей структуры - митохондриально-ретикулярной сети. Сеть испытывает обратимые процессы распада и восстановления-слияния. Именно это обратимое изменение структуры лежит в основе вовлечения митохондрий в ответы на возбуждение. Нельзя не отметить, что это представление развивалось в 60-е годы в Институте биофизики в Москве А.Л. Шабада-шом. Исследования современного уровня значительно глубже пр оникают в механизмы распада и слияния сети, но идея о р егулято рном значении этого пр оцесса по существу та же и еще больше укрепляется.
Если все так ясно, то, казалось бы, надо отказаться от принятых методов и развивать новый способ, со хр аняющий эту структуру. Это было нелегко и психологически, и методически. Сначала это было трудно самим авторам, потом было трудно для восприятия сообществом. Методическое описание опубликовано в работах [5,6]. Здесь мы только кратко остановимся на идейных трудностях и помощи биофизического подхода в их преодолении.
Митохондр иологи химического склада спокойно относятся к процедурам размельчения тканей, их центрифугированию и промывке как при работе с растворами.
Сопоставление с микроскопическими исследованиями распада и сбор ки сети показывало, что эти привычные процедуры уничтожают сеть. Поэтому даже при закреплении лимфоцитов на стекле в природном окружении плазмы крови было необходимо тщательно подбирать состав и концентрации компонентов для сохранения нежной структуры, соединяющей отдельные органеллы. Вдохновляющим примером важности тончайшего подбора условий для исследования образования свободных радикалов на лиофилизированных или замороженных образцах тканей являются работы Л .А. Блюмен-фельда, тщательно описанные в последующих руководствах ([1], сс. 183-199). Л .А. представляет полученные результаты в тесной связи с, казалось бы, минорными отличиями приготовления препаратов, скорости замораживания, времени поддержания низкой температуры, изо-
ляции лиофилизированного препарата от атмосфер ной влаги. Такие вариации приводят к появлению артефактов. На исследуемые про -цессы влияют помещение растворимых компонентов на белковые подложки, замещение воздуха аргоном и др угие условия. Вариации отработанных условий привлекают внимание биохимиков гораздо меньше.
Сейчас ситуация меняется. В последнее время появилось несколько публикаций, критикующих традиционное выделение митохондрий [7,8].
Таким образом, сохранение нативной структуры обязательно для выявления тонких структур ных переходов молекул пр и работе ферментов. Особенно Л. А. подчеркивал важность обнаружения неравновесного состояния фермента пр и активации субстратом или другими факторами. Переведение фермента в такую форму является именно тем этапом, на который затр ачивается энергия для совершения работы. Эта стадии подобна взведению кур ка для выстрела. Сам рабочий акт уже не требует затраты энергии, а обеспечивается разрядкой накопленного потенциала - спуск курка - релаксация фер мента. Следовательно, для совершения р а -боты фермент в живой системе должен быть в особом неравновесном состоянии, поддержание которого обеспечивается различными механизмами. Это же мнение высказывали другие мыслители, начиная от Э.С. Бауэр а.
Теперь это пионерское мнение стало общепринятым. Как помнится, Л. А. принадлежит особенно удачное выражение, подчеркивающее активный характер установления неравновесного состояния: «Выведенное из равновесия со -стояние фермента», что соответствует употреб -ляющейся в квантовой химии формулировке: «специально приготовленное» ([2], сс. 70-83). Он рассматривал в общем виде и на конкретных примерах возможные механизмы такого выведения
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.