НЕЙРОХИМИЯ, 2014, том 31, № 1, с. 31-35
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК [547.458.2:577.157.2]+587.12
СОСТОЯНИЕ ТИОЛ-ДИСУЛЬФИДНОГО РАВНОВЕСИЯ И СИСТЕМЫ ОКСИДА АЗОТА В ТКАНЯХ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС
С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ ОНМК: ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ НООТРОПОВ © 2014 г. И. Ф. Беленичев, С. В. Горбачева*, А. В. Демченко, Н. В. Бухтиярова
Запорожский государственный медицинский университет
Моделирование острого нарушения мозгового кровообращения (ОНМК) сопровождалось нарушением тиол-дисульфидного равновесия, снижением активности МО-синтазы и повышением уровня нитротирозина, что указывает на развитие оксидативного и нитрозативного стресса в тканях головного мозга. При введении тиотриазолина и а-липоевой кислоты устанавливается наиболее оптимальное соотношение между уровнями восстановленных и окисленных тиольных групп, а также глутатиона, что свидетельствует об активной мобилизации тиол-дисульфидной системы в нейтрализации продуктов свободно-радикального окисления. Выявленные эффекты тиотриазолина и а-липоевой кислоты обусловлены наличием в их структуре тиольной группы, что позволяет этим препаратам нормализовать состояние системы глутатиона в условиях окислительного стресса.
Ключевые слова: острое нарушение мозгового кровообращения, тиол-дисульфидноеравновесие, тиотриазо-лин, а-липоевая кислота, система глутатиона.
DOI: 10.7868/S1027813314010051
ВВЕДЕНИЕ
Главным источником свободно-радикального окисления при церебральной ишемии является состояние гипоксии, приводящее к изменению функционирования глутатионовой и аскорбат-ной редокс-систем, а также к нарушениям метаболизма оксида азота и простагландинов [1, 2]. Активные формы кислорода в условиях развития патологического состояния, "атакуют" белки, липиды и нуклеиновые кислоты клеток, приводя к их окислительной модификации [3].
Гиперпродукция активных форм кислорода, а именно супероксид-радикала, гидроксил-радика-ла, МО-радикала, а впоследствии и пероксинитри-та (ОМОО-), играющих ключевую роль в развитии оксидативного и нитрозативного стресса, вызывает повреждение макромолекул. В последнее время появились работы, в которых убедительно доказывается роль МО и ОМОО— в патогенезе нейродеге-неративных заболеваний [1—3].
Учитывая известную роль процессов свободно-радикального окисления в развитии осложнений со стороны ЦНС можно полагать, что их адекватное ограничение может оказаться эффек-
* Адресат для корреспонденции: 69035 Украина, Запорожье, пр. Маяковского, д. 26; e-mail: swg18@yandex.ua.
тивным подходом к коррекции нарушенных церебральных функций при ОНМК.
Доказано, что наиболее важную в биологическом плане роль играют окислительно-восстановительные реакции, в ходе которых тиоловые группы легко окисляются с образованием дисуль-фидных группировок, и вновь регенерируют при их восстановительном расщеплении. Возникающая на основе этих превращений обратимая тиолдисульфидная система (ТДС) имеет очень большое значение в регуляции окислительно-восстановительного равновесия в клетках и тканях организма [4, 5].
При этом ТДС заслуживает особого внимания и в расширении представлений о механизмах ци-тотоксичности МО и гибели нейронов.
Система глутатиона, представленная восстановленным глутатионом (С8И) и ферментами его метаболизма — глутатионпероксидазой (ГПО), глутатионтрансферазой и глутатионредуктазой (ГР), является одной из ведущих антиоксидантных систем в организме и играет ключевую роль в толерантности нейронов головного мозга к ишемии [5—8]. В частности, глутатион непосредственно либо посредством ферментативных реакций эффективно защищает клетки от свободных радикалов и других реактивных разновидностей кислорода, например, гидроксильного радикала, липид-
32
БЕЛЕНИЧЕВ и др.
пероксильного радикала, пероксинитрита и перекиси водорода. Помимо этого глутатион принимает участие в функционировании глутаредоксин-зависимой системы, играющей важную роль в поддержании внутриклеточного редокс-гомеоста-за [2].
Исходя из вышесказанного, оптимизация терапевтических стратегий направленных на борьбу с нарушениями когнитивных функций связанных с цереброваскулярной недостаточностью является актуальной. В настоящее время представление о препаратах, способных предотвратить или уменьшить повреждение ЦНС, развивающееся вследствие воздействия на нервную систему различных токсических факторов, стало шире, чем нейропро-текция. Ряд авторов считают, что более точным, чем нейропротекция, является термин церебро-протекция, так как для сохранения функции мозговой ткани необходима защита всех клеток, включая глию и эндотелий сосудов [9—11].
Для коррекции осложнений цереброваскуляр-ной природы широко используются ноотропные препараты. Как известно, в основе их действия на ЦНС лежат два принципиальных эффекта — влияние на интеллектуально-мнестические функции и церебропротекторный. Благодаря своему благоприятному воздействию на когнитивную сферу, структуру и функции нейрональных мембран, стимуляцию энергообеспечения и биосинтеза белка в мозге, нейротрофические эффекты, но-отропы могут рассматриваться как важнейший компонент комплексной лечебной стратегии ОНМК [12].
Вышесказанное определяет поиск новых возможностей коррекции и фармакологических методов предупреждения осложнений со стороны ЦНС, при заболеваниях, в патогенезе которых ключевую роль играет повышение активности процессов свободно-радикального окисления в частности при ОНМК.
Целью исследований было определение влияния препаратов церебропротекторной и ноотроп-ной терапии — пирацетама, тиотриазолина и а-липоевой кислоты на состояние тиол-дисульфид-ного равновесия и системы оксида азота в тканях головного мозга крыс с экспериментальным ОНМК.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследования проводились на 50 белых крысах линии Вистар массой 200—250 г, содержащихся в стандартных условиях вивария (температура воздуха: 22 ± 2°С, светлый/темный цикл: 12/12 часов) и распределенных на 5 групп: I — интактные, п = 10; II — животные с экспериментальным ОНМК (контроль), п = 10; III - ОНМК + пираце-там в дозе 500 мг/кг, п = 10; IV — ОНМК + тиотри-
азолин в дозе 100 мг/кг, n = 10, V — ОНМК + а-ли-поевая кислота в дозе 50 мг/кг n = 10. Все экспериментальные процедуры и оперативные вмешательства осуществляли в соответствии с "Положением об использовании лабораторных животных в биомедицинских исследованиях". Острое нарушение мозгового кровообращения вызывали необратимой двухсторонней окклюзией общих сонных артерий. Процедуру выполняли под этаминал-натриевым наркозом (40 мг/кг), путем хирургического доступа выделяли общие сонные артерии, подводили под них шелковые лигатуры и перевязывали. Из эксперимента животных выводили под этаминал-натриевым наркозом (40 мг/кг) [13].
Для иммуноферментных и биохимических исследований использованы фрагменты, находящихся в области сенсо-моторной зоны коры головного мозга и гомогенизированные в жидком азоте. Цитозольную фракцию выделяли методом дифференциального центрифугирования (15000 g) при температуре +4°C на 0,15 М фосфатном буфере рН 7.8. Безбелковый экстракт получали добавлением точного количества гомогената ткани мозга в хлорную кислоту (0.6 М) с последующей нейтрализацией 5.0 М калия карбонатом. Содержание нитротирозина определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа с использованием стандартного тест-набора "Ni-trotirosine ELISA Kit" ("HyCult biotechnology") в соответствии с прилагаемой к набору инструкции. Уровень гомоцистеина в гомогенате тканей мозга определяли энзиматическим методом с помощью стандартного тест-набора производства "PLIVA-Lachema Diagnostika" в соответствии с прилагаемой к набору инструкции. Уровень SS- и SH-групп определяли спектрофотометрически, с последующим вычислением тиол-дисульфидного коэффициента — ТДК = SH/SS [14]. Содержание окисленного и восстановленного глутатиона определяли флюорометрически [14]. Активность глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы опрелеляли спектрофотометрически [15]. Активность цистатионин^-синтазы определяли спектрофотометрически [14]. Содержание метионина и цистеина в гомогенате определяли хромотогра-фически [15].
Для определения активности NO-синтазы использовали цитозольную фракцию гомогената головного мозга. Точную навеску гомогената помещали в 50 мМ Трис-НС1 буфере рН 7.4 (содержащий 2 мМ ЭДТА и 2 мМ дитиотрейтола (три-тон-Х)) в соотношении 1 : 7 и центрифугировали при +4°C при 15000 g в течение 45 минут. Инкубационная смесь с рН 7.4 содержала 25 мМ трис-НС1, 5 мМ MgC12, 0.1 мМ CaC12, 1 мМ НАДФ, 1 мМ L-аргинина. В термостатирующую кювету помещали нагретую до +37°C инкубационную смесь и запускали реакцию добавлением 0.1 мл цитозоля.
Таблица 1. Влияние пирацетама, тиотриазолина и а-липоевой кислоты на некоторые показатели тиолдисуль-фидного равновесия в головном мозге крыс с ОНМК
Группы животных SH-группы ммоль/г белка SS-группы ммоль/г белка Глутатион восст. ммоль/г ткани Глутатион окисл. ммоль/г ткани ГР усл. ед./ (мин • г ткани) ГПР усл. ед./ (мин • г ткани)
Ложноопери-рованные 19.1 ± 1.8 3.5 ± 0.2 4.3 ± 0.83 0.33 ± 0.08 19.5 ± 1.35 61.8 ± 2.9
ОНМК 4.8 ± 0.62 17.2 ± 1.64 0.62 ± 0.1 0.76 ± 0.1 5.2 ± 0.72 14.2 ± 1.54
ОНМК + + пирацетам 5.2 ± 0.27 13.5 ± 0.78 0.64 ± 0.12 0.55 ± 0.05 6.2 ± 0.61 17.5 ± 1.95
ОНМК + + тиотриазолин 10.3 ± 0.65*# 5.1 ± 0.43*# 3.1 ± 0.2*# 0.4 ± 0.06* 14.8 ± 0.74*# 42.6 ± 2.24*#
ОНМК + + а-ЛК 9.8 ± 0.46*# 7.4 ± 0.61*# 3.3 ± 0.75*# 0.41 ± 0.07 10.1 ± 0.85* 31.7 ± 2.19*#
Примечание: *р < 0.05 по отношению к группе животных с ОНМК, #р < 0.05 по отношению к группе животных с ОНМК и введением пирацетама.
Измеряли оптическую плотность сразу, а затем через 4 минуты при длине волны 340 нм [16].
С целью проведения терапии препараты вводили внутрибрюшинно указанными дозами 1 раз в сутки на протяжении 18 дней, начиная с 1 дня после перевязки общих сонных артерий. Животным I та II групп на протяжении исследования в соответствующем объеме внутрибрюшинно вводили физиологический раствор.
Отличия между группами оценивали статистически с использованием параметрического критерия t-Стьюдента с помощью программы "Biostat" и MS Excel
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.