ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 1, с. 85-91
УДК 581.1
СОВМЕСТНОЕ ВЛИЯНИЕ ГИББЕРЕЛЛОВОЙ И АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТ НА ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ И АКТИВНОСТЬ АНТИОКИСЛИТЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ В ПРОРОСТКАХ СОИ
ПРИ ОБРАБОТКЕ НИКЕЛЕМ
© 2007 г. С. Саиди-Сар*, Р. А. Хавари-Неджад*' **, X. Фахими*, М. Горбанли***, А. Мажд*' **
* Кафедра биологии, Научно-исследовательский отдел, Исламский университет Азад, Тегеран, Иран ** Кафедра биологии, Педагогический университет, Тегеран, Иран *** Кафедра биологии, Отделение в Горгане, Исламский университет Азад, Горган, Иран
Поступила в редакцию 08.08.2005 г.
Исследовали влияние никеля в сочетании с аскорбиновой (АК) и гибберелловой (ГК) кислотами на семидневные проростки сои. Воздействие в 0.25 мМ NiCl2 х 6H2O в течение 5 сут привело к появлению признаков токсичности, таких как образование красновато-коричневых крапчатых пятен на листовой пластинке. Добавление 0.05 мМ ГК или 1 мМ АК ослабило токсическое действие никеля. После их одновременного воздействия признаки отравления не появлялись. В присутствии Ni снижались сухая масса корней и побегов, а также содержание хлорофилла в листьях, повышался уровень малонового диальдегида и активности липоксигеназы, а также менялись активности ферментов антиоксидантной защиты, таких как каталаза, гваяколпероксидаза и аскорбатпероксидаза. Как в корнях, так и в листьях Ni вызывал окислительный стресс. Проростки, обработанные Ni и выдержанные затем в присутствии АК или ГК, или, в особенности, - с АК + ГК, отличались усиленным ростом по сравнению с исходными, обработанными Ni растениями. ГК снижала поглощение Ni корнями, а АК заметно тормозила передвижение Ni из корней в побеги. Совместное действие АК и ГК предотвращало снижение уровня хлорофилла и перекисное окисление липидов, а также увеличивало активность антиокислительных ферментов. Полученные результаты позволяют предположить, что обработка ГК + АК противодействовала отрицательному влиянию Ni на проростки сои.
Glycine max - аскорбиновая кислота - ГК - никель - окислительное повреждение
ВВЕДЕНИЕ
Фитотоксическое действие тяжелых металлов может вызываться образованием активных форм
кислорода (АФК), таких как 02, Н202 и ОН [1], которые воздействуют на процессы в клетке, связанные главным образом с функционированием мембранных систем [1-5]. Никель - это один из наиболее распространенных тяжелых металлов, загрязняющих окружающую среду. В достаточно высоких концентрациях № индуцирует окислительный стресс [6, 7]. Через перекисное окисление липидов № может влиять на целостность
Сокращения: АК - аскорбиновая кислота; АП - аскорбатпероксидаза; АФК - активные формы кислорода; ГП - гваяколпероксидаза; КАТ - каталаза; ЛО - липоксигеназа; МДА - малоновый диальдегид; ТБК - 2-тиобарбитуровая кислота.
Адрес для корреспонденции: S. Saеidi-Sar. Islamic Azad University, Science and Research Branch; р.о. вох 14155-775, Iran, Tehran. Fax: 0098 (021) 88848940; e-mail: s-saeidisar@yahoo.com
мембран и вызывать торможение роста [8]. Показателем перекисного окисления липидов служит малоновый диальдегид (МДА) - продукт расщепления полиненасыщенных ЖК [9]. Перекисное окисление липидов может также инициироваться ферментативным путем под действием липоксигеназы (ЛО), которая катализирует превращение полиненасыщенных ЖК в их сопряженные производные с использованием молекулярного кислорода [10].
Конъюгированные для защиты от окислительного стресса растительные клетки содержат ферменты, обезвреживающие кислородные радикалы, такие как супероксиддисмутазу (СОД), каталазу (КАТ), гваяколпероксидазу (ГП) и ас-корбатпероксидазу (АП). Для этой цели они содержат также антиоксиданты неферментативной природы, такие как глютатион, каротиноиды, аскорбиновую кислоту и а-токоферол [1-3]. Аскорбиновая кислота (АК) служит в растениях важным антиоксидантом. Ранее была описана ан-тиоксидантная система, включающая процесс регенерации АК, которая участвует в защите расте-
ний против окислительного стресса, индуцированного тяжелыми металлами [11].
В то же время, было высказано предположение о том, что ГК играет ключевую роль в защите растений от стресса. Торможение роста растений в условиях стресса может вызываться изменением гормонального баланса, и обработка гормонами может служить весьма действенным средством для преодоления стресса [12].
В последние годы информация, касающаяся преодоления токсического действия тяжелых металлов, в частности Ni, была недостаточной. Цель настоящей работы состояла в том, чтобы исследовать токсическое действие Ni и возможную защитную роль экзогенного аскорбата и/или ГК против индуцированного Ni окислительного стресса у проростков сои.
МЕТОДИКА
Реактивы. Большинство реактивов, таких как ГК, АК, поливинилполипирролидон, 2-тиобарби-туровая кислота (ТБК), альбумин, Твин-20, лино-левая кислота и гваякол, получали от фирмы "Sigma" (США), а другие реактивы, такие как Н202, были аналитической чистоты.
Растительный материал и его обработка. Семена сои (Glycine max L., сорт Union х Elf) стерилизовали 20%-ным раствором NaClO3 в течение 5 мин и затем тщательно промывали дистиллированной водой. Семена проращивали в стерильной песчаной культуре, проростки поливали в течение 5 суток разбавленным наполовину раствором Хогланда. Далее молодые проростки выращивали в 300-миллилитровых контейнерах на полном растворе Хогланда (по 3 растения на контейнер). Проростки в возрасте 7 суток переносили на свежую среду, содержавшую хлорид никеля в концентрации 0.25 мМ в присутствии 1 мМ АК, 0.05 мМ ГК, или АК + ГК или в их отсутствие. Раствор непрерывно продували воздухом и ежедневно заменяли свежим, а рН раствора ежедневно приводили к 6.5. Растения выращивали в камере фитотрона. Интенсивность света при выращивании составляла 175 мкмоль квантов/(м2 с), длина светового дня - 16 ч, температура -26°/22°С (день/ночь), относительная влажность воздуха - 65 ± 5%. Через 5 суток опыт заканчивали, растения промывали деионизированной дистиллированной водой. Пробы для определения сухой массы и содержания никеля высушивали при 70°С в течение 48 ч. Сырой растительный материал для определения активности ферментов замораживали жидким азотом и хранили при -70°С.
Определение никеля. Сухие корни и побеги озоляли в смеси азотной и хлорной кислот (5 : 1 по объему) [13]. Никель определяли методом атом-
ноабсорбционной спектрофотометрии на приборе Spectra АА-200 (Австралия).
Определение хлорофилла и малонового ди-альдегида. Содержание суммы хлорофиллов определяли в ацетоновых экстрактах по методу Arnon [14]. Уровень перекисей липидов в листьях и корнях определяли по содержанию малонового диальдегида (МДА) с помощью реакции с ТБК по методу Molassiotis с соавт. [3].
Экстракция ферментов. Замороженный растительный материал (корни или листья) растирали с 100 мМ охлажденного до 0°С фосфатного буфера, рН 7.0, 0.1 мМ №2-ЭДТА, 1%-ного (вес/объем) нерастворимого поливинилполипир-ролидона и 0.2 мМ АК [15]. Гомогенаты очищали центрифугированием при 12000 g при 4°С в течение 60 мин. Содержание белка определяли по методу Bradford [16], используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.
Определение активности ферментов. Активность КАТ (КФ 1.11.1.6) определяли по разложению Н202, измеряя понижение поглощения света при 240 нм в течение 1 мин [2]. Реакционная смесь (3 мл) содержала 100 мМ калий-фосфатного буфера, рН 7.5, и 25 мМ Н202. Активность ГП (КФ 1.11.1.7) определяли в реакционной смеси (3 мл), содержавшей 50 мМ калий-фосфатного буфера, рН 7.0, 0.1 мМ ЭДТА, 5 мМ Н202 и 30 мМ гваякола [17]. Увеличение поглощения света, вызванное образованием тетрагваякола, измеряли при 470 нм. Активность АП (КФ 1.11.1.11) определяли, регистрируя снижение поглощения света при 290 нм, вызванное окислением аскорбата [15]. В 3 мл реакционной смеси содержалось 0.5 мМ АК, 0.1 мМ Н202 и 0.1 мМ ЭДТА в 50 мМ фосфатного буфера, рН 7.0. Активность Л0 (КФ 1.13.11.12) определяли при 234 нм, используя линолевую кислоту в качестве субстрата [18]. Реакционная смесь (1 мл) содержала 0.0228 мМ ли-нолевой кислоты и 0.25%-ый Твин-20 в 0.2 М цит-ратно-фосфатном буфере, рН 6.5; увеличение поглощения света при 234 нм измеряли в течение 10 мин.
Активность КАТ, ГП, АП и Л0 выражали в единицах на мг белка. Единицу активности фермента определяли как его количество, необходимое для разложения 1 мкмоля (для КАТ и ГП) или 1 нмоля (для АП и Л0) субстрата в мин. Все спек-трофотометрические анализы проводили при 25°С на спектрофотометре Shimadzu UV-2 101 PC (Япония).
Статистическая обработка данных. Все представленные данные являются средними арифметическими величинами для трех независимых опытов. Статистические расчеты выполняли с использованием статистических компьютерных программ MSTATC и SPSS1-1. Средние величины
для всех вариантов сопоставляли друг с другом, применив программу ANOVA и тест Duncan.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Типичные признаки токсичности №, такие как хлороз и появление красновато-коричневых крапчатых пятен на листовых пластинках, наблюдали визуально после трех дней обработки. Добавление АК или ГК в питательный раствор ослабляло токсичность никеля, а при совместном использовании АК и ГК признаки стресса не проявлялись вовсе.
В проростках, обработанных №, никель накапливался в большей степени в корнях, чем в побегах. В присутствии ГК содержание никеля в корнях снижалось. В присутствии АК обработанные никелем растения накапливали в побегах, но не в корнях, намного меньше №, чем просто обработанные № растения. Наименьшее содержание № в побегах было отмечено после обработки АК + ГК (таблица).
Влияние №, АК и/или ГК или АК + ГК на рост проростков по изменению сухой массы корней и побегов показано в таблице. После обработки № интенсивность роста значительно снижалась. В корнях и побегах содержание сухой массы снижалось на 40 и 52%, соответственно, по сравнению с контрольными растениями. Растения, обработанные № и АК или ГК, были затронуты в меньшей степени, а у растений, обработанных № и АК + ГК, не проявлялись снижение роста и признаки хлороза или некроза листьев. Растения сои, обработан
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.