ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2010, том 46, № 1, с. 89-95
УДК 576.382.7.:633.41
СОЗДАНИЕ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ГЕН bar
© 2010 г. Я. В. Мишуткина, А. М. Камионская, К. Г. Скрябин
Центр "Биоинженерия"РАН, Москва, 117312 e-mail: yana@biengi.ac.ru Поступила в редакцию 17.11.2008 г.
Оптимизированы параметры трансформации с использованием линии Agrobacterium tumefaciens ЕНА 105 для 5 отечественных сортов и линий сахарной свеклы (Beta vulgaris L. var. saccharifera (Alef) Krass). Разработана система селекции трансгенных тканей, основанная на устойчивости к фосфинотрицину, позволяющая избежать возникновения химерных побегов среди первичных трансформантов. Получены трансгенные растения сахарной свеклы сортов Рамонская односемянная 47, Льговская односемянная 52 и линий РМС 73, ЛБО 17 и ЛБО 19, экспрессирующих ген фосфинотрицинацетилтрансферазы (bar) и показана их высокая устойчивость к действию фосфинотрицина in vitro.
Сахарная свекла — важнейшая техническая культура, являющаяся сырьем для производства 35—40% сахара в мире. Для России это традиционный и основной отечественный источник получения сахара. Ежегодно в Российской Федерации эту культуру высевают на площади около 1 млн.га. При возделывании сахарной свеклы основная доля расходов производителя приходится на борьбу с сорной растительностью [1], при этом потери от сорняков могут составлять 25—30% [2]. За последние 15 лет ситуация усложнилась, так как вследствие ряда экономических и агротехнических причин (в первую очередь из-за низкой эффективности борьбы с патогенными микроорганизмами, сорняками и насекомыми-вредителями), произошло сильное засорение полей патогенами, что привело к снижению урожайности и, как следствие, уменьшение производства сахара из сахарной свеклы и увеличение использования импортного сахара-сырца (более 50%).
Проблему засоренности полей можно эффективно решать применением гербицидов, но при культивировании сахарной свеклы этот процесс становится многостадийным и трудоемким в связи с тем, что данная культура обладает повышенной чувствительностью к действию большинства гербицидов.
Эта проблема может быть решена методами генной инженерии, применение которых позволит ввести в процесс "традиционной" селекции сахарной свеклы генотипы, обладающие устойчивостью к действию гербицида.
В настоящее время большинство исследований по трансформации выполнены на сортах и гибридах иностранной селекции, которые имеют ряд недостатков при выращивании в климатических условиях РФ: неустойчивы к заболеваниям в поле, склонны к загниванию корнеплодов при хранении [3, 4].
Несмотря на то, что первые трансгенные растения сахарной свеклы были получены в 1990 г. [5], до сих пор существует ряд факторов, ограничивающих эффективность генетической трансформации этой культуры. Наиболее значимыми из них можно назвать эффективность регенерации и трансформации сахарной свеклы в культуре in vitro, которые, в значительной степени, являются генотип-зависимыми процессами. Ранее нами были оптимизированы протоколы регенерации побегов из различных типов эксплантов сахарной свеклы (каллус из сегментов гипокотилей, семядольные узлы, черешки листьев), для семи отечественных сортов и гибридов [6].
Цель работы — оптимизировать параметры агробактериальной трансформации и создать трансгенные линии сахарной свеклы, экспрес-сирующие ген bar.
МЕТОДИКА
Растительный материал. Использовали широко районированные на территории РФ сорта Льговская односемянная 52 и Рамонская односемянная 47 и компоненты гибридов РМС 73, ЛБО 17, ЛБО 19, любезно предоставленные Всероссийским научно-исследовательским институтом сахарной свеклы и сахара им. А.Л. Мазлумова РАСХН (г Воронеж) и Центром "Биоинженерия" РАН.
Состав сред и условия культивирования. Растительный материал культивировали при температуре 23—25°С, с 16 часовым фотопериодом. В базовый состав всех питательных сред входили макро- и микроэлементы MS [7], витамины [8], сахароза (30 г/л) и агар-агар (8 г/л). Стерилизацию проводили по модифицированной методике Кренса [9]. Стерильные семена высаживали в пробирки со средой базового
состава, с добавлением 1 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП) и 0.5 мг/л 2,3,5-трийодбензойной кислоты (ТИБК), и проращивали в темноте при 22—25°С.
Индукция образования побегов из семядольных узлов. Проростки помещали в чашку Петри и скальпелем отсекали апекс побега с семядолями, оставляя нижележащую область гипокотиля длиной 1.5—2 мм, использовали по 1 сегменту каждого проростка. Индукцию регенерации проводили на базовой среде с 0.5—1 мг/л БАП (в зависимости от генотипа) [6].
Клональное микроразмножение. Проростки помещали в чашку Петри и скальпелем отсекали корешок с частью гипокотиля. Апекс с семядолями и верней частью гипокотиля переносили в контейнеры, содержащие базовую среду с 0.25 мг/л БАП. Пересадку побегов проводили каждые 2 нед. Размноженные листья с почками при каждой пересадке разделяли и культивировали независимо для продолжения цикла клонального микроразмножения. Через 2—3 пассажа наружные листья розетки использовали для получения черешков листа, внутренние листья оставляли на среде для дальнейшего размножения.
Индукция регенерации побегов из черешков листа. Лист от клона отсекали таким образом, чтобы вместе с черешком оставалась область побега длинной 3— 5 мм. Индукцию побегообразования проводили на базовой среде с 0.5 мг/л БАП и 0.1 мг/л 1-нафтилук-сусной кислоты (НУК).
Бактериальные штаммы и плазмиды. Для трансформации использовали штамм Agrobacterium tume-faciens EHA105 (любезно предоставленный Елизабет Худ [10]), содержащий плазмиды pNRGFPBAR (из коллекции Н.В. Раввина, Центр "Биоинженерия" РАН, Москва), pVec035 [11, 12] и pBar [13, 14].
Плазмида pBAR содержала кассету экспрессии гена bar под контролем ^5^—промотора и NOS-тер-минатора. Плазмида pNRGFPBAR содержала кассету экспрессии гена bar под контролем NOS-про-мотора и NOS—терминатора и гена gfp с интроном под контролем JJS—промотора и NOS-терминато-ра. Плазмида pVec035 содержала кассету экспрессии гена gus (uidA) с интроном под контролем JJS-про-мотора и NOS—терминатора и гена hptII под контролем NOS—промотора и NOS—терминатора.
Подготовка агробактериальной культуры к трансформации. A. tumefaciens EHA105 выращивали в жидкой среде LB (с селективными антибиотиками) [15] в течение 1 сут при 28°С. Затем 5 мл культуры разбавляли 50 мл среды АВ [16] (без антибиотиков) с добавлением 200 мкМ ацетосирин-гона и культивировали при 28°С, пока плотность D600 не достигала 1. Полученную культуру разбавляли в 2.5—3 раза жидкой средой MS (непосредственно перед трансформацией).
Сокультивация эксплантатов с Agrobacterium tumefaciens. Выделение эксплантов проводили за день
или в день трансформации. Далее экспланты инкубировали с разведенной культурой A. tumefaciens в течение 30, 60 или 90 мин, затем переносили на стерильную фильтровальную бумагу и далее — на чашки Петри с твердой средой MS (концентрация макро- и микроэлементов MS 10%) с ацетосирингоном (200 мкМ) для сокультивации. Экспланты сокульти-вировали 3 или 4 сут при 25—28°С. Эксперимент проводили в трех повторностях по 28 эксплантов (всего 84). В каждом опыте использовали экспланты всех генотипов.
Определение оптимальной концентрации селективного агента. 4-дневные экспланты помещали на среду для генерации побегов с различными концентрациями фосфинотрицина (ФТ) — 0.5, 1, 2, 4 и 8 мг/л, по 25 эксплантов на чашку. Пересадку побегов проводили каждые 14 сут. Эксперимент проводили в трех повторностях по 50 эксплантов (всего 150). В каждом опыте использовали экспланты всех генотипов.
Полимеразно-цепная реакция (ПЦР). Выделение геномной растительной ДНК проводили согласно стандартной методике [17]. Для проведения ПЦР были выбраны две пары специфических праймеров для гена bar (BarAtf — ggcggacatgccggcggtctgcacc, BarAtr — cagcccgatgacagcgaccacgct) и две для vir-гена агробактерии (Vir1 — ggctacatcgaagatcgtatgaatg, Vir2 — gactatagcgatggttacgatgttgac):
ПЦР осуществляли на ДНК-амплификаторе Techne ("Genius", Великобритания). Продуктами ПЦР являлись фрагменты гена bar размером 339 пар нуклеотидов (п.н.) и гена vir размером 669 п.н.
Определение экспрессии гена bar. Анализ был проведен с помощью набора фирмы "Strategic Diagnostics", США, который позволял детектировать фермент фосфинотрицин—N—ацетилтрансферазу (ФАТ), экспрессируемый геном bar (илиpat).
Секвенирование ПЦР-фрагментов и анализ нук-леотидных последовательностей. Секвенирование продуктов амплификации было проведено группой секвенирования Центра "Биоинженерия" РАН по методу Сэнгера [18], с помощью набора реактивов фирмы "Applied Biosystems", (США) на автоматическом секвенаторе ABI PRIZM 3730 ("Applied Biosystems", США) согласно инструкциям производителя.
Редактирование полученных секвенсных спектрограмм проводили с помощью программы Chromas, версия 1.45. Первичный сравнительный анализ полученных de novo последовательностей с последовательностями базы данных GenBank проводили с помощью программы NCBI Blast. Редактирование последовательностей проводили с помощью редактора BioEdit.
Блот-гибридизация. Блот-гибридизацию проводили согласно стандартной методике по Саузерну [19]. Для рестрикции геномной ДНК использовали эндонуклеазу Еco RI, имеющую единственный сайт
Таблица 1. Влияние времени поранения, сокультивации в жидкой и на твердых средах на частоту транзиентной экспрессии шйА (£И5)
Прекультивация экс- Время жидкой со- Время сокультивации Кол-во эксплантов с Частота транзиент-
плантов, ч культивации, мин на твердой среде, сут экспрессией gus, шт.* ной экспрессии, %
0 30 3 29 34.5 ± 1.90
4 29 34.5 ± 1.90
60 3 32 38.1 ± 1.92
4 34 40.5 ± 3.84
90 3 25 29.8 ± 1.90
4 неконтролируемый рост A. tumefaciens
24 30 3 41 48.8 ± 3.81
4 43 51.. ± 1.90
60 3 50 59.5 ± 3.81
4 56 66.7 ± 1.90
90 3 47 56.0 ±1.90
4 неконтролируемый рост A. tumefaciens
* Общее количество эксплантов — 84 шт.
узнавания в районе Ж^-терминатора, в кассете экспрессии pBAR.
Определение экспрессии гена gfp. Оценку экспрессии ген
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.