ГЕНЕТИКА, 2008, том 44, № 10, с. 1420-1428
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 575.174:591
СПЕКТР МУТАЦИЙ В ГЕНЕ 21-ГИДРОКСИЛАЗЫ У БОЛЬНЫХ С ВРОЖДЕННОЙ ГИПЕРПЛАЗИЕЙ КОРЫ НАДПОЧЕЧНИКОВ
В БАШКОРТОСТАНЕ
© 2008 г. В. Л. Ахметова1, 3. Ф. Рамова2, О. А. Малиевский2, Э. К. Хуснутдинова1
1Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, Уфа 450054;
e-mail: vita-akh@mail.ru
2Башкирский государственный медицинский университет, кафедра госпитальной педиатрии, Уфа 450000;
e-mail: malievsky@list.ru Поступила в редакцию 28.03.2008 г.
Проведено молекулярно-генетическое изучение врожденной гиперплазии коры надпочечников (ВГКН) у 59 больных из Республики Башкортостан, представленных двумя основными группами: 35 больных с сольтеряющей формой заболевания и 24 - с простой вирильной формой. В результате анализа гена CYP21A2 у больных с врожденной гиперплазией коры надпочечников из Республики Башкортостан на 81.58% хромосом было идентифицировано семь различных мутаций: деле-ция/конверсия гена delA2orLGC, R356W, I2splice, I172N, Q318X, V281L и P30L, в том числе на 89.71% хромосом у больных с сольтеряющей формой и на 69.57% хромосом - с простой вирильной. С наибольшей частотой 30.83% обнаружена делеция/конверсия гена delA2orLGC. У шести больных ВГКН идентифицировано три разных кластера мутаций на одной хромосоме: Q318X + R356W, I172N + Q318X, delA2orLGG + V281L. Установлено 100%-ное соответствие фенотипа генотипу для мутаций, приводящих к частичному снижению активности 21-гидроксилазы и простой вирильной форме.
Врожденная гиперплазия коры надпочечников (ВГКН), или адреногенитальный синдром (АТС), -группа аутосомно-рецессивных заболеваний, обусловленных наследственными дефектами ферментов, участвующих в сложном многоступенчатом процессе биосинтеза стероидных гормонов коры надпочечников. 90-95% случаев заболевания связаны с дефицитом фермента 21-гидроксилазы (цито-хром Р450с21), катализирующего превращение прогестерона в дезоксикортикостерон и 17а-гид-роксипрогестерона в 11-дезоксикортизол [1-4]. Данная форма ВГКН очень разнообразна по клиническим проявлениям и степени тяжести: наиболее распространенным является "классический" вариант заболевания с выраженной недостаточностью фермента, основным признаком которого является внутриутробная вирилизация, более редким вариантом - "неклассическая" или "поздняя" форма с умеренно выраженным ферментативным дефектом, проявляющаяся в постнатальном периоде. Классическую форму подразделяют на сольтеряющую форму, которая характеризуется полным дефицитом фермента и проявляется в нарушении солевого обмена с угрожающими жизни сольтеряющими кризами, и простую вирильную форму с прогрессирующей вирилизацией и ускоренным соматическим развитием [3-7].
Частота "классической" формы ВГКН варьирует в зависимости от этнической принадлежности и географической зоны - от 1 : 280 у эскимо-
сов Аляски до 1 : 42000 у афро-американцев США [8-10]. Согласно данным скрининга 6.5 млн. новорожденных в 13 странах мира, средняя частота "классической" формы заболевания составляет 1 : 15000, при этом 60% приходится на сольтеряющую форму, а 33% - на простую вирильную, частота гетерозиготного носительства - 1 : 60 [10]. Частота "неклассической" формы варьирует от 1 : 27 до 1 : 333 в зависимости от популяции [6, 10].
Недостаточность 21-гидроксилазы обусловлена мутациями в кодирующем ее гене СУР21, локализованном на коротком плече хромосомы 6 (6р21.3) рядом с главным комплексом гистосов-местимости (МНС, ИЬЛ). Идентифицировано два высокогомологичных гена - псевдоген СУР21А1 (СУР21Р), неактивный вследствие ряда мутаций, и функционально активный ген СУР21А2 (СУР21), расположенных друг за другом на расстоянии около 30 тпн (рис. 1). Оба гена имеют размер около 3.1 тпн и состоят из 10 экзонов, отличаясь друг от друга на 87 нуклеотидов [2, 3, 6, 11]. Наличие рядом двух гомологичных ДНК-последовательностей часто ведет к нарушению спаривания хромосом во время мейоза и, как следствие этого, либо к генной конверсии (перемещению фрагмента активного гена на псевдоген), либо к делеции части смыслового гена, либо к многочисленным точечным мутациям и к нарушениям сплайсингового процесса. В любом случае это приводит к изменению нуклеотидной последовательности активного гена
и, соответственно, к нарушению активности фермента [2, 3, 5, 6, 12].
В настоящее время в активном гене CYP21A2 идентифицировано около 100 различных мутаций, обусловливающих дефицит 21-гидроксила-зы. Из них 95% составляют крупные делеции (delA2) гена и 9 точечных мутаций, всегда присутствующих в псевдогене и перенесенных в активный ген в результате генных конверсий: Q318X, F306+1nt, I2splice, I172N, V281L, P30L, Eócluster, G110del8nt, R356W [3, 5-7].
Степень дефицита 21-гидроксилазы и тяжесть заболевания тесно связаны со степенью инактивации фермента, зависящей от мутаций, имеющихся в геноме больного. В зависимости от места локализации и характера мутационных повреждений в гене CYP21A2 степень инактивации фермента может варьировать в широких пределах, что, возможно, и является одной из причин гетерогенности клинических проявлений недостаточности ВГКН [3, 6].
Медико-генетическое консультирование пациентов и членов их семей, а также скрининговые программы с целью выявления гетерозиготных носителей мутаций в гене CYP21A2 необходимо проводить с учетом спектра мутаций, характерного для каждого конкретного региона.
Целью настоящей работы являлось исследование гена CYP21A2 у больных ВГКН из Республики Башкортостан и сопоставление идентифицированных мутаций с клиническими формами заболевания.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использованы образцы ДНК больных с клиническим диагнозом "врожденная гиперплазия коры надпочечников", состоящих на учете в отделении эндокринологии в Республиканской детской клинической больнице г.Уфы, и членов их семей. Обследовано 59 больных ВГКН, в том числе два сибса с одинаковой формой заболевания, и 96 членов их семей. 35 больных имели сольтеряющую форму ВГКН (СТФ) (59.32%), 24 больных - простую вирильную форму (ПФ) (40.68%).
Кровь из вены в количестве 4-8 мл набирали в пробирки с консервантом 0.5 М ЭДТА (рН 8.0) в соотношении 8 : 2. Образцы ДНК выделяли из цельной крови стандартным методом ферментативного гидролиза с протеиназой К и последующей фенольно-хлороформной экстракцией [13].
Для скрининга 11 наиболее распространенных мутаций гена CYP21A2: large gene deletion (delA2), large gene conversion (LGC), P30L, I2splice, G110del8nt, I172N, V281L, E6cluster, F306 + 1nt, Q318X, R356W, мы применили различные виды ПЦР с использованием праймеров, описанных ранее [5, 14-17], и, если это было необходимо, с последующим рестрикционным анализом.
Делецию около 30 тин (delA2) и большие конверсии (LGC) анализировали с иомощью иолуко-личественной ПЦР с ираймерами, иозволяющи-ми амилифицировать фрагмент, содержащий 3-й экзон как гена, так и исевдогена [14] (табл. 1). В 3-м экзоне исевдогена локализована делеция размером 8 ин, иоэтому ири амилификации этого эк-зона выявлялись два фрагмента: иервый размером 150 ин соответствует иседогену, второй (158 ин) - гену. После ироведения электрофореза в 8% ПААГ (исходное соотношение акриламида и метиленби-сакриламида 29 : 1.3) и окраски бромистым этиди-ем сравнивалась интенсивность свечения ири УФ обоих фрагментов. Соотношение ген-исевдоген 1 : 2 (количество коиий) свидетельствует о делеции гена в гетерозиготном состоянии, 1 : 3 - о возможной конверсии между этими двумя генами, наличие только одного фрагмента 150 ин - о де-леции или конверсии в гомозиготном состоянии. Так как интенсивность свечения и размер фрагмента оиределяются субъективно, то точно оире-делить вид мутаций с иомощью этого метода невозможно. Необходимо иодтверждение иолучен-ных результатов с иомощью блот-гибридизации ио Саузерну. Учитывая, что и конверсия, и делеция являются мутационными иовреждениями гена CYP21Ä2, мы эти мутации не стали иодразде-лять, обозначив их как delA2orLGC.
Так как все исследованные нами точковые мутации гена CYP21Ä2 являются результатом их ие-реноса с исевдогена вследствие генных конверсий, то для их идентификации в активном гене необходимо было амилифицировать только фрагменты активного гена. Для этого были ис-иользованы ираймеры, иозволяющие амилифицировать только активный ген вследствие того, что в состав одного из них включена иоследова-тельность нуклеотидов, комилементарная делеции 8 ин в 3-м экзоне исевдогена.
Для идентификации мутаций I2splice, I172N и F306+1nt ирименена аллель-сиецифичная ПЦР с ираймерами, с иомощью которых амилифициру-ются фрагменты, соответствующие как норме, так и мутации. Кроме того, обязательно исиоль-зовали контрольный ираймер, который в случае отсутствия мутации или нормы иоказывает наличие амилификации.
Мутации V281L, E6cluster, Q318X и R356W исследовали с иомощью амилификации фрагмента активного гена размером 1489 ин с иоследующим рестрикционным анализом соответствующей эн-донуклеазой: V281L - PmaCl, E6cluster - Adel, Q318X - Pstl и R356W - Acil.
Для оиределения мутации P30L амилифициро-вали фрагмент активного гена в 770 ин и иодвер-гали гидролизу эндонуклеазой Acil.
Для идентификации делеции G110del8nt иро-водили двухстуиенчатую ПЦР: на иервом этаие -
Таблица 1. Праймеры, использованные в работе, и условия амплификации
м
д
M H
s >
н о £
g
О
о о
Мутация Праймер Последовательность Температура отжига, °C Размеры фрагментов, пн Литературная ссылка
Делеция/конверсия ЗехопС YP21A2/C YP21A1 F-CTC CTG CAG АСА AGC TGG TG R-GAA СТС CTG GGT CAG CTG CT 65 150 158 [14]
I2splice 656A F-ACC СТС CAG CCC CCA А 56 85 [15,16]
656C F-ACC CTC CAG CCC CCA С 57 85
656G F-ACC CTC CAG CCC CCA G 58 85
CYP5 (контрольный) F-GGT GCT GAA CTC CAA GAG G 352
CYP48 (общий обратный с дел. 8 пн) R-CAG AGC AGG GAG TAG TCT С 58
I172N I172N-A I172N-T I172N-K (контрольный) CYP55 (общий прямой с дел. 8 пн) R-CCG AAG GTG AGG TAA CAG А R-CCG AAG GTG AGG TAA CAG T R-CGG TAG CAT CAC TGG CTG TGG F-CCT GTC CTT GGG AGA СТА CT 58 322 322 770 [15,16]
F306+1nt CYP1768I (Wt) R-TG GTG
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.