ХИМИЯ ВЫСОКИХ ЭНЕРГИЙ, 2007, том 41, № 2, с. 129-134
= ФОТОХИМИЯ =
УДК 535.37
СПЕКТРАЛЬНО-КИНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ 3,3'-ДИЭТИЛ-9-ХЛОРТИАКАРБОЦИАНИНА С ДНК
© 2007 г. П. Г. Пронкин, А. С. Татиколов, В. А. Кузьмин
Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук
119991, Москва, ул. Косыгина, 4 E-mail: tatikolov@sky.chph.ras.ru Поступила в редакцию 08.06.2006 г.
Спектрально-флуоресцентными и кинетическими методами исследовано взаимодействие мезоза-мещенного карбоцианинового красителя 3,3'-диэтил-9-хлортиакарбоцианинперхлората (ДХТКЦ) с ДНК в растворах фосфатного буфера (pH 7). Показано, что в водных и водно-спиртовых растворах краситель находится главным образом в виде цис-изомера. В результате взаимодействия с ДНК обнаружено образование комплекса транс-формы ДХТКЦ, который затем постепенно (в течение десятков минут) переходит в комплекс цис-изомера красителя. Обнаружено существенное влияние концентраций реагентов и ионной силы раствора на кинетику транс-цис-перестройки комплекса ДХТКЦ, что свидетельствует о сложном характере данного процесса.
Причиной значительного интереса, который в настоящее время уделяется исследованиям взаимодействия полиметиновых (цианиновых) красителей с различными биомакромолекулами (нуклеиновыми кислотами, полисахаридами, белками, пептидами), служат уникальные фотофизические и фотохимические свойства этих красителей [1, 2], благодаря которым цианиновые красители широко применяются для исследования нуклеиновых кислот [3, 4], в биомедицине [5, 6].
Одним из важных процессов в молекулах полиметиновых красителей является цис-транс-изоме-ризация относительно связей полиметиновой цепи [1, 2], при этом в растворах мезозамещенных красителей наблюдается одновременное присутствие в сравнимых концентрациях полностью транс- и цис-изомеров [7, 8]. Равновесие между цис- и транс-изомерами сильно зависит от свойств микроокружения молекул красителей, что позволяет использовать данные красители в качестве зондов при изучении молекулярно-организованных систем [9].
Влияние биомакромолекул на транс-цис-изо-меризацию мезозамещенных цианиновых красителей ранее рассматривалось в ряде работ [10-12]. Обнаружено, что комплексообразование мезозамещенных анионных тиакарбоцианинов с альбумином приводит к цис-транс-изомеризации молекул красителей, это свидетельствует о наличии сильных электростатических полей в сайтах связывания белка [12]. В случае катионных тиакарбо-цианиновых красителей с мезозаместителями большого размера авторами было показано, что образование комплексов с ДНК приводит к ощутимому сдвигу равновесия между цис- и транс-изомерами красителей и протекает преимущественно через цис-формы лигандов [10].
В настоящей статье приведены результаты изучения равновесия между цис- и транс-изомерами мезозамещенного тиакарбоцианинового красителя 3,3'-диэтил-9-хлортиакарбоцианинперхлората в полярных и неполярных растворах, а также влияния на цис-транс-равновесие взаимодействия с молекулами дНк в водных растворах. В данной работе впервые удалось наблюдать относительно медленный переход связанного с ДНК комплекса транс-изомера ДХТКЦ в комплекс, образованный цис-формой.
ДХТКЦ
МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА
Измерения спектров поглощения красителя и кинетики их изменения во времени проводились на спектрофотометре "Shimadzu ЦУ-3101 РС" (Япония) в стандартной кювете (1 см). Исследование флуоресценции ДХТКЦ проводилось на спектро-флуориметре "Shimadzu RF-5301PC". Оптические плотности растворов красителя ДХТКЦ составляли ~0.1-0.2 (что соответствует концентрации ~10-6 моль/л, молярный коэффициент поглощения £дхткц ~2 х 105 л моль-1 см-1). При изучении взаимодействия красителя с ДНК краситель, растворенный в спирте, вводился в водный раствор биополимера в фосфатном буфере (рН 7), при этом объемное содержание спирта в системе не превышало 1-2%. Такая концентрация спирта не
А
X, нм
Рис. 1. Спектры поглощения красителя ДХТКЦ (сдхткц = 1-8 х 10-6 моль/л), в смесях изопропанол-вода различного состава, с содержанием изопропано-ла 100 (1), 66.7 (2), 50 (3), 41.7 (4), 33.3 (5), 16.7 (б) и 0 об. % (7).
оказывала существенного влияния на свойства ДНК.
В работе использовали краситель, предоставленный научным центром НИИХИМФОТОПРОЕКТ (Б.И. Шапиро) и коммерческую ДНК цыпленка ("Реанал", Венгрия) [13]. Концентрация ДНК определялась с использованием коэффициента экстинк-ции пары оснований 8 = 13200 л моль-1 см-1 при длине волны 250 нм [14]. В качестве растворителей использовали фосфатный буфер рН 7 (концентрация 20 ммоль/л), изопропанол, метанол, ацетонитрил, диметилсульфоксид, диоксан-1,4 (марки "х. ч.").
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Спектры поглощения и флуоресценции. В спектрах поглощения красителя, полученных в системах изопропанол-вода, наблюдается зависимость структуры и интенсивности полос поглощения ДХТКЦ от содержания спирта в растворе (рис. 1, кривые 1-7). При относительно высоком содержании изопропанола (вплоть до 50 об. %) наблюдается интенсивная длинноволновая полоса поглощения (Хтах = 553 нм; рис. 1, кривые 1-3). Уменьшение доли спирта (41.7 и 33.3 об. %, кривые 4, 5) приводит к падению интенсивности и небольшому коротковолновому сдвигу длинноволновой полосы (Хтах = 550 нм) в спектрах ДХТКЦ, которые сопровождаются ростом коротковолнового пика (Хтах = 517 нм), и при содержании спирта 16.7 об. % длинноволновая полоса практически полностью исчезает (кривая б). В водном растворе наблюдается гипсохромный сдвиг (Хтах = 512 нм), падение
интенсивности и уширение коротковолновой полосы поглощения.
Аналогично ранее исследованным мезозаме-щенным тиакарбоцианиновым красителям [10], а также на основании работы [7] длинноволновая полоса в спектрах ДХТКЦ (рис. 1, кривые 1-3) была отнесена к поглощению транс-изомера, а коротковолновая - к цис-изомеру. Как и для других исследованных мезозамещенных тиакарбоциани-нов [10], понижение полярности растворителя вызывает сдвиг изомерного равновесия в сторону образования транс-формы. Наблюдаемое в водных растворах падение интенсивности и уширение полосы поглощения цис-формы ДХТКЦ, вероятно, объясняется образованием агрегатов молекул красителя.
В спектрах ДХТКЦ, изученных в менее полярных, чем вода, органических растворителях (в изо-пропаноле, ацетонитриле, диметилсульфоксиде, диоксане-1,4), наблюдается одна длинноволновая полоса, которая относится к поглощению трансизомера. Положение этой полосы зависит от растворителя: в ацетонитриле максимум поглощения красителя наблюдается при 550 нм, в неполярном диоксане-1,4 происходит его батохромный сдвиг на 11 нм (Хтах = 561 нм). Наблюдаемые сдвиги полос поглощения транс-изомера красителя объясняются влиянием показателя преломления растворителей [1]. В то же время в более полярном растворителе - в воде краситель присутствует главным образом в виде цис-изомера.
В системах изопропанол-вода наблюдается зависимость структуры и интенсивности спектра флуоресценции от состава системы (рис. 2). В спектрах флуоресценции ДХТКЦ в растворе изопропанола наблюдается одна полоса с максимумом 566 нм (рис. 2, кривая 4), соответствующая испусканию транс-изомера. Спектры возбуждения красителя в изопропаноле по форме и положению максимума удовлетворительно совпадают со спектром поглощения транс-изомера красителя в спирте (спектры возбуждения флуоресценции не приведены). Однако в водном растворе красителя при возбуждении в области поглощения цис-изо-мера (Хех = 505 нм) наблюдаются две малоинтенсивные полосы флуоресценции с максимумами 546 и 583 нм (рис. 2, кривая 1). При этом длинноволновая полоса испускания принадлежит транс-изомеру ДХТКЦ, присутствующему в небольшой концентрации в водном растворе наряду с цис-фор-мой, поскольку в спектрах возбуждения флуоресценции длинноволновой полосе соответствует полоса с максимумом 572 нм. Коротковолновой полосе флуоресценции (ХПтах = 546 нм) в спектрах возбуждения флуоресценции соответствует полоса с максимумом 450 нм, которую нельзя соотнести с поглощением цис- и транс-изомерных форм ДХТКЦ. Она не может быть обусловлена наличием примесей в образце красителя,
поскольку не наблюдается в спирте и в других органических растворителях. Увеличение доли изопро-панола в системе до 42-58 об. % (рис. 2, кривые 3, 4) приводит к значительному уменьшению интенсивности коротковолновой полосы флуоресценции красителя, в спектрах она присутствует в виде плеча, вместе с тем, положение максимума длинноволновой полосы флуоресценции (транс-изомер) остается практически постоянным (554-556 нм). Авторы относят эту коротковолновую полосу флуоресценции ДХТКЦ к испусканию агрегатов (имеющих поглощение в области 450 нм), которые краситель образует в водных растворах. Отсутствие полосы цис-формы красителя в спектрах флуоресценции обусловлено тем, что цис-изоме-ры у тиакарбоцианиновых красителей имеют гораздо меньшие величины квантовых выходов флуоресценции по сравнению с транс-изомерами [8].
Спектры поглощения красителя в присутствии ДНК были изучены в растворах фосфатного буфера при различных концентрациях биополимера (сдНК = 0 - 2.5 х 10-4 моль/л). Значительные изменения в спектрах поглощения ДХТКЦ в присутствии ДНК указывают на образование некова-лентных комплексов красителя с биополимером.
Как отмечалось выше, в растворах фосфатного буфера (рН 7) спектр поглощения свободного красителя ДХТКЦ (сдНК = 0 моль/л) представляет собой коротковолновую полосу его цис-изомера с максимумом 512 нм (рис. 3а, кривая 1). Непосредственно после введения красителя в раствор ДНК в спектрах появляется интенсивный длинноволновый пик поглощения, соответствующий транс-изомеру ДХТКЦ (Хтах = 556 нм), а полоса поглощения цис-формы красителя менее интенсивна (коротковолновый пик, рис. 3а, кривая 3). Появление пика транс-изомера объясняется стабилизацией трансформы красителя, введенной в систему в виде спиртового раствора, в комплексе с ДНК. Однако образующийся в присутствии ДНК комплекс транс-изомера оказывается неустойчивым и в дальнейшем претерпевает перестройку. С течением времени (в интервале минут - десятков минут) в спектрах наблюдае
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.