ж
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2002, том 2S, № 3, с. 220-235
УДК 547.92:542.91:543.422.25
СПЕКТРОСКОПИЯ ЯМР В ИЗУЧЕНИИ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ И ВНУТРИМОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИНАМИКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ АНАЛОГОВ СТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ
© 2002 г. С. И. Селиванов", А. Г. Шавва
Химический факультет Санкт-Петербургского государственного университета, 198504, Санкт-Петербург, Старый Петергоф, Университетский просп., 26 Поступила в редакцию 20.07.2001 г. Принята к печати 23.01.2002 г.
Особенности применения гомо- и гетероядерных корреляционных методов спектроскопии ЯМР в одном и двух измерениях для определения пространственной структуры и изучения внутримолекулярной подвижности модифицированных аналогов стероидных гормонов (МАСГ) и тактика их использования как для отнесения сигналов в высокопольной области спектров 'Н-ЯМР, так и для определения наиболее важных стереоспецифических параметров - вицинальных констант спин-спи-нового взаимодействия (КССВ) VH_H и ядерных эффектов Оверхаузера (ЯЭО) обсуждаются на примерах ЯМР-изучения структуры нескольких различных эстрогенов и андрогенов при 300 МГц и анализа литературных данных. Учет спектральных и релаксационных свойств МАСГ в жидкости, включая анизотропность общего диффузионного движения, позволяет в каждом случае определить наиболее эффективную комбинацию этих методов и отобрать необходимую модификацию каждого из них. Для МАСГ характерно широкое применение корреляций через дальние КССВ (COS Y-45, DQF-COSY), использование значений 4'5^н-н Для установления пространственной структуры и преимущество гетероядерных методов HSQC с развязкой и без развязки от ядер 13С над соответствующими методами HMQC не только по разрешающей способности, но и по чувствительности. Для конформационно жестких МАСГ на оценку межпротонных расстояний посредством калибровочного метода обработки данных спектров NOE-difference и NOESY сильно влияет анизотропность общего диффузионного движения этих молекул в жидкости, приводящая в зависимости от соотношения между полярными углами эталонного и измеряемого расстояний как к заниженным, так и к завышенным значениям этих расстояний. Показана возможность появления при определенных условиях у конформационно мобильных МАСГ дополнительного вклада скалярного механизма релаксации между скалярно связанными протонами, который приводит к заниженным значениям наблюдаемых ЯЭО и соответствующим ошибкам в определении расстояний между ними.
Ключевые слова: андрогены: эстрогены: ЯМР; пространственная структура; косвенные спин-спиновые взаимодействия: ядерный эффект Оверхаузера (ЯЭО).
ВВЕДЕНИЕ
Модифицированные аналоги стероидных гормонов (как эстрогенов, так и андрогенов) широко используются в терапии целого ряда тяжелых заболеваний [1-3]. Исследование механизмов действия этих групп гормонов привело к появлению новых препаратов для лечения таких тяжелых болезней, как остеопороз, атеросклероз, ишемия и т.д. [4-8]. Терапевтические свойства применяемых препаратов во многом определяются кон-формацией стероидов в растворе. Поэтому одной из основных задач при целенаправленном синтезе
Сокращения: КМ - корреляционные методы; КССВ - константа спин-спинового взаимодействия; МАСГ - модифицированные аналоги стероидных гормонов; РСА - рентге-ноструктурнын анализ; ХС - химический сдвиг; ЯЭО -ядерный эффект Оверхаузера.
# Автор для переписки (тел.: (812) 428-43-25; факс: (812) 428-69-36; эл. почта: nmr@paloma.spbu.ru).
соединений данного класса и при установлении зависимости между их структурой и биологической активностью является определение особенностей их пространственного строения, включая получение информации о внутримолекулярной динамике. Среди методов, позволяющих успешно решать эту задачу, важное место занимает спектроскопия ЯМР, использование которой в кон-формационном анализе основано на стереоспеци-фичности констант спин-спинового взаимодействия (КССВ) [9-11] и высокой чувствительности ядерного эффекта Оверхаузера (ЯЭО) к межъядерным расстояниям [12]. Поэтому корректное определение значений КССВ и оценка межпротонных расстояний г,у, наиболее существенных для установления конформации, являются целью изучения молекул в растворе методами ЯМР.
Эти параметры обычно используются в качестве исходных данных для молекулярного моделиро-
вания и наряду с результатами рентгеноструктур-ного анализа (РСА) служат основным источником информации об особенностях пространственного строения и внутримолекулярной динамики стероидных гормонов. Хотя подтверждение структуры стероидных гормонов может быть также получено на основании характеристичных ХС ядер 13С [13-15] и значений прямых и дальних гетероядерных КССВ '-3УС. -н [Ю' 11]» прямой подход связан с использованием спектроскопии 'Н-ЯМР и изучением прямых и косвенных гомоядерных диполь-ди-польных взаимодействий.
Однако анализ протонных спектров МАСГ, как правило, существенно затруднен из-за перекрывания мультиплетных сигналов приблизительно двадцати алифатических протонов в узкой области спектра 0.8-2.5 м.д. Поскольку все же именно в этой области содержатся сведения о наиболее важных для установления конформации параметрах, -вицинальных КССВ и скоростях кросс-релаксации (ЯЭО) между протонами колец стероидной молекулы, необходимым предварительным условием успешного решения поставленной задачи является полное и однозначное отнесение всех сигналов в спектре 'Н-ЯМР с помощью комбинированного использования корреляционных методов (КМ) спектроскопии ЯМР в одном и двух измерениях [16-18].
Данная работа посвящена анализу проблем, связанных с использованием спектроскопии ЯМР для конформационного анализа МАСГ с учетом их специфических спектральных и релаксационных особенностей, и определению наиболее приемлемых для данного класса соединений путей их решения. Очевидно, что общая стратегия применения ЯМР, основанная на разделении различного рода взаимодействий с помощью импульсных последовательностей [18], едина для всех химических соединений и не зависит от их размера. Однако тактика использования конкретных методов анализа спектров сложны« спиновых систем может зависеть от класса соединений, которые, в частности, могут отличаться по релаксационным характеристикам, непосредственно связанным с размером молекул [12].
В случае МАСГ, кроме указанного выше перекрывания сигналов в высокопольной области спектра 'Н-ЯМР, следует учитывать их молекулярную массу (300-400), наличие значительного числа спин-спиновых взаимодействий, включая дальние (через 4-7 связей), относительно короткие времена спин-решеточной релаксации (Т,) алифатических протонов (0.3-1.0 с) и протонированных ядер '3С метановых и метиленовых групп (0.4-1.5 с), значительную анизотропность диффузионного движения стероидных молекул [19-21] и, наконец, возможность быстрых (в шкале времени ЯМР) конформационных перестроек [22-25].
Следует также отметить, что многие КМ спектроскопии ЯМР были разработаны с учетом особенностей спектральных и релаксационных свойств макромолекул и их применение к "ма-
лым" молекулам, для которых время корреляции диффузионного движения тс и рабочая частота спектрометра со0 находятся в соотношении со0тс 1, не всегда оказывается столь же эффективным. Более того, интерпретация результатов и методические рекомендации по использованию таких КМ могут оказываться противоположными для этих двух типов молекул. Поэтому в настоящей работе основное внимание уделяется тем отличительным методическим приемам использования ЯМР для установления конформации и изучения внутримолекулярной динамики МАСГ в растворе, которые наиболее типичны для этого класса соединений, учитывая литературные сведения и результаты ЯМР-исследований нескольких различных их представителей на частоте 300 МГц.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
МАСГ содержат два основных сорта магнитных ядер: 'Н и 13С. Поэтому вся необходимая информация, подтверждающая принадлежность изучаемой молекулы к конкретному стереохимическому ряду, может быть получена на основании анализа двух соответствующих спектров ЯМР с использованием характеристичных ХС отдельных сигналов. Так, например, принадлежность эстрогенов к 8-изоряду легко установить по величинам ХС ядер 13С в положениях 1, 6, 8 и 14 [14] и протонов HI и Н18 (С13-СН3) [26, 27]. Благодаря простоте такой эмпирический подход достаточно хорошо применим к наиболее изученным стереохимическим рядам и получил широкое распространение.
Развитие КМ спектроскопии ЯМР привело к появлению нового, более доказательного подхода, основанного на комбинированном использовании всех спектральных параметров стероидной молекулы и возможности последовательного отнесения всех сигналов в спектрах 'Н- и 13С-ЯМР. Эти методы значительно упростили процедуру анализа перекрывающихся областей спектров стероидов [28-30] и позволили использовать спектрометры с относительно невысокой рабочей частотой (300 МГц). Одним из доказательств преимущества такого подхода может служить появление в последнее время работ, посвященных исключительно исправлению отнесений некоторых сигналов в спектрах 'Н- и 13С-ЯМР известных соединений, сделанных ранее на основании эмпирических правил. Очевидно, что тактика использования КМ ЯМР зависит также от характера перекрывания сигналов, который может существенно отличаться даже для структурно близких стероидных молекул. Можно выделить два крайних случая: перекрывание сигналов протонов, входящих в разные спиновые подсистемы (например, алифатических протонов, находящихся в различных кольцах стероида), и протонов, принадлежащих к одной спиновой подсистеме. На практике чаще встречается комбинация этих вариантов.
13-Ме
. м. Д.
Рис. 1. Перекрывание сигналов в высокопольной области спектров 'Н-ЯМР соединений (I) (а), (II) (б) и (III) (е). Сильносвязанные группы сигналов показаны с помощью сплошных, а слабосвязанные - пунктирных линий. Сигналы протона Н4 в соединениях (I) и (II) получены с помощью процедур дополнительной предварительной обработки сигнала свободной индукции: дополнения нулями до 128 К и использования прямого линейного предсказания (CDCI3, 20°С).
В качестве примера на рис. 1 приведены высо- мо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.