ОНТОГЕНЕЗ, 2008, том 39, № 5, с. 362-366
БИОХИМИЯ РАЗВИТИЯ =
УДК 547
СПОНТАННАЯ АКТИВАЦИЯ ЯИЦ РЫБ ПРЕДОТВРАЩАЕТСЯ
ИНГИБИТОРАМИ ПРОТЕАЗ1
© 2008 г. А. А. Минин, С. Г. Озерова
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 119334 Москва, ул. Вавилова, д. 26 E-mail: mininand2002@yahoo.com Поступила в редакцию 19.06.07 г.
Окончательный вариант получен 17.01.08 г.
Известно, что при нересте попадающая во внешнюю водную среду икра большинства рыб сохраняет способность к оплодотворению лишь на протяжении короткого времени. Это связано с так называемой спонтанной активацией яиц, сопровождающейся образованием оболочки оплодотворения, которая при нормальном оплодотворении препятствуют проникновению сверхчисленных и чужеродных спермиев в яйцо. В настоящей работе показано, что формирование оболочки яйца и утрата способности к оплодотворению, происходящие в водных растворах разного состава, подавляются ингибиторами протеаз, в частности лейпептином и апротинином. Высказывается предположение о наличии природных ингибиторов протеаз в овариальной жидкости, которые предотвращают спонтанную активацию яйца. Возможным объяснением активации яйца без участия спермия является снижение концентрации этих ингибиторов при разведении овариальной жидкости в водной среде в условиях нереста.
Ключевые слова: экзоцитоз, Misgurnus fossilis, 12-О-тетрадеканоилфорбол-13-ацетата, форбол-12,13-дибутирата.
При взаимодействии яйца со спермием в процессе оплодотворения происходит активация яйца - включение программы развития. Одним из первых результатов активации является образование так называемой оболочки оплодотворения, предотвращающей проникновение в яйцо сверхчисленных спермиев. У низших позвоночных, развитие зародышей которых происходит в воде (рыбы, амфибии), оболочка оплодотворения является к тому же защитной, состоящей из внешнего слоя, который до активации прилегал к поверхности неактивированного яйца, и студенистого, сильно обводненного внутреннего слоя, образующегося из экзоцитирующегося содержимого кортикальных гранул яйца. Экзоцитоз кортикальных гранул инициируется у большинства групп животных проникновением в яйцо спермия.
Активация и оплодотворение яиц рыб были подробно рассмотрены и описаны ранее (Гинзбург, 1968). Для рыб характерно внешнее оплодотворение, при этом процесс активации чаще всего может идти в отсутствие спермия и запускаться при попадании яйца в водную среду, что минимизирует время возможного оплодотворения, предотвращая возможность проникновения в яйцо сверх-
1 Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проект < 05-04-48975).
численных и чужеродных спермиев. Происходящая при этом так называемая спонтанная активация яйца сопровождается образованием оболочки оплодотворения, аномальной ооплазматической сегрегацией и неправильным дроблением, а в дальнейшем - гибелью. Отделение оболочки оплодотворения от поверхности яйца, которая становится видимой в нормальных условиях через несколько минут после начала активации, является простым и легко наблюдаемым признаком произошедшей активации яйца.
Внутриклеточные сигнальные процессы, связанные с активацией яйца и запускающие процесс развития, широко исследуются у разных животных, в том числе и у рыб (вПкеу е! а1., 1999; Ьее е! а1., 1999). Центральным среди этих процессов является, в частности, повышение концентрации свободных ионов кальция. Экзоцитоз кортикальных гранул в яйце рыб, приводящий к образованию оболочки оплодотворения, вероятно, активируется ионами кальция и включает в себя целый каскад событий, в том числе реорганизацию кортикального слоя актина в яйце (1уапепкоу е! а1., 1990; Бескег, Иай, 1999). Было показано, что у рыб при спонтанной активации яйца, как и при нормальном оплодотворении, происходит волнообразное повышение концентрации ионов кальция (Ьее е! а1., 1999). Механизм самого раннего, локального, повышения концентрации
ионов кальция в анимальной части яйца при активации в отсутствие спермия остается при этом неизвестен (Ьее е! а1., 1999), что указывает на существование каких-то неизвестных сигнальных процессов, которые при этом происходят.
В ряде работ исследовался процесс активации яйца без спермия в солевых средах разного состава (ИаП, Уи, 1980; Ьее е! а1., 1999; вПкеу е! а1., 1999). Обычно при экспериментах на неактивированной икре для предотвращения активации используют овариальную или, по-другому, полостную жидкость, при этом не обязательно взятую от рыб того же вида; в частности, при работе с яйцами данио используют овариальную жидкость лосося (Сойеу^ткИ е! а1., 1995). Остаются открытыми вопросы, какие именно компоненты овари-альной жидкости предотвращают активацию яйца рыб и каков механизм активирующего действия воды.
Цель нашей работы - выяснение особенностей активации яйца рыб в воде и водных растворах разного состава, а также исследование природы ингибирующего действия овариальной жидкости на этот процесс.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
В работе использовали неоплодотворенные яйца вьюна Misgurnus fossilis, полученные после стимуляции рыб внутрибрюшинной инъекцией гона-дотропного гормона (Костомарова, Нейфах, 1964).
Активацию яйца оценивали по двум критериям. Первый - отхождение оболочки оплодотворения, которое наблюдали визуально под бинокулярной лупой после активирующего воздействия. В случае активации оболочка оплодотворения отделяется от поверхности яйца и становится видимой в течение нескольких минут. Этот критерий использовали для качественной оценки способности разных растворов предотвращать активацию яйца. Для количественной характеристики сохранения способности к оплодотворению в средах разного состава использовали второй критерий - подсчет погибших неоплодотворенных зародышей, которые гибнут у вьюна ко времени, соответствующему стадии средней бластулы-ранней гаструлы. Сохранение способности к оплодотворению определяли после двухчасовой инкубации икры вьюна в исследуемом растворе. Оплодотворяли и инкубировали икру вьюна по стандартной методике (Костомарова, Нейфах, 1964).
Активирующее действие на яйца вьюна фор-боловых эфиров исследовали, добавляя 12-О-тет-радеканоилфорбол-13-ацетата (ТФА) и форбол-12,13-дибутирата (ФДБ) в концентрации 0.1-1 мкМ.
Таблица 1. Спонтанная активация яиц вьюна в водных средах разного состава
Среда Отделение оболочки
название состав, мМ оплодотворения после 10 мин инкубации Источник
Раствор Рингера для золотой рыбки NaCl - 100, KCl - 2.5, NaHCO3 - 10, MgCl2 - 1, CaCl2 - 1 + Ivanen-kov et al., 1990
Бескальциевый раствор Рингера NaCl - 100, KCl - 2.5 NaHCO3 - 10, MgCl2 - 1, ЭГТА - 5 + Там же
БВББ NaCl - 137, KCl - 5.36, MgCl2 - 0.98, NaHPO4 - 0.81, декстроза - 5 + Becker, Hart, 1999
БВББ + альбумин То же + 0.5%-ный бычий сывороточный альбумин + Lee et al., 1999
Раствор Хенкса NaCl - 137, Na2HPO4 - 0.25, KCl - 5.4, NaHCO3 - 4.2, MgSO4 - 10, CaCl2 - 1.3 +
То же То же + лей- -
с лейпептином пептин - 1
То же То же + 1мг/мл -
с апротинином апротинина
Сыворотка крупного рогатого скота
Овариальная жидкость -
Использовали следующие солевые среды: раствор Рингера для золотой рыбки (Goldfish Ringer's); FBSS (Fish Balanced Salt Solution), мМ: 137 NaCl, 5.36 KCl, 0. 98 MgCl2 ■ 6 H2O, 0.81 NaHPO4 x 7 H2O и 5 декстрозы (Becker, Hart, 1999); FBSS и 0.5%-ный бычий сывороточный альбумин (Lee et al., 1999). В некоторых экспериментах использовали те же солевые растворы с добавлением 1-5 мМ ЭГТА.
Овариальную жидкость вьюна получали центрифугированием неоплодотворенной икры при 10000g.
Таблица 2. Выживаемость зародышей вьюна, полученных из икры разных самок (1-5), инкубированной перед оплодотворением 2 ч в растворе Хенкса с добавлением разных концентраций лейпептина
Концентрация лейпептина, мМ Икра 1 Икра 2 Икра 3 Икра 4 Икра 5
^бщ^ж (%) о/к ^бщ^ж (%) о/к ^бщ/Нж (%) о/к Нобщ/Нж (%) о/к Нобщ/Нж (%) о/к
Контроль, 0 42/38 (90) 32/29 (91) 49/44 (90) 25/22 (88) 157/77 (48)
0.005 59/51 94 29/29 111 74/11 29
0.015 52/50 105 36/23 70 85/17 42
0.03 59/49 92 58/55 104 32/26 90 40/35 99 77/18 48
0.06 59/53 98 22/20 100 32/25 87 43/37 98
0.125 23/21 100
0.25 44/41 102
0.5 34/25 81 35/30 94 34/25 84 84/27 66
1 54/54 110
Примечания. Кобщ , Кж - количество икринок в пробе и зародышей, выживших на стадии средней-поздней гаструлы соответственно; о/к - отношение процента выживших зародышей при разных концентрациях лейпептина в пробе к проценту выживших в контрольной пробе.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Исследовали спонтанную, т.е. происходящую без участия спермия, активацию яиц вьюна в водных средах разного состава (табл. 1).
В недавних работах для предотвращения спонтанной активации яиц рыб были предложены бескальциевые солевые растворы с декстрозой и бычьим сывороточным альбумином (Beker, Hart, 1999; Lee et al., 1999). Во второй из указанных работ оговаривается, что был использован бычий альбумин фракции V - частично очищенный белок, получаемый из сыворотки спиртовым осаждением. Однако в наших экспериментах все эти среды, в частности с использованием высокоочи-щенного сывороточного альбумина (альбумин фракции V мы не использовали), вызывали активацию яиц вьюна и данио. Повторение экспериментов c добавлением в солевую среду вместо очищенного альбумина нефракционированной бычьей сыворотки показало, что яйца не активировались даже при разведении сыворотки в десять раз. Это наблюдение позволяет предположить, что в сыворотке или в препаратах неочищенного альбумина могут содержаться какие-то ингибирующие активацию компоненты.
Кроме того, объяснение результатов указанных авторов по отсутствию активации яиц в солевых водных средах может быть связано с тем, что овариальная жидкость сохраняет способность предотвращать активацию даже при разведении. Однако в указанных работах не приводятся условия разведения получаемой в овариальной жидкости икры в солевых растворах, поэтому прове-
рить это наше предположение не представляется возможным.
Описанное выше показывает необходимость получения ответа на вопрос: что же предотвращает активацию созр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.