ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2009, том 425, № 1, с. 120-122
КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 591.862:591.436.2:576.535.5
спонтанный многенез в первичнон культуре эмбриональной печени крысы
© 2009 г. О. В. Паюшина, О. Н. Хныкова, Н. Н. Буторина, М. Н. Кожевникова, В. И. Старостин
Представлено академиком Н.Г. Хрущовым 05.06.2008 г. Поступило 10.06.2008 г.
Строма эмбриональной печени известна как источник мезенхимных стромальных клеток (МСК), обладающих остео-, адипо- и хондроген-ными потенциями [1]. Есть данные и о миогенной дифференцировке стромальных клеток этого органа в индукционной среде [2], при культивировании в особых условиях [3] и при слиянии с клетками скелетных мышц [4]. Мы обнаружили, что в первичной культуре эмбриональной печени крысы возможно спонтанное образование миосим-пластов.
При культивировании клеток печени 16-17-су-точных плодов крыс Wistar в среде a-MEM с 10% сыворотки плодов коровы большинство клеток имели морфологию фибробластов, но в некоторых случаях среди них присутствовало небольшое число симпластов с числом ядер от 2-3 до нескольких десятков. Симпласты имели вытянутую форму - от веретеновидных, треугольных или V-образных клеток с хаотично расположенными ядрами до очень длинных и узких с одним рядом ядер. Цитоплазма отличалась интенсивной ба-зофилией, иногда в ней были видны тонкие продольные волокна; ядра имели рыхлую структуру и часто содержали ядрышки (рис. 1). Как правило, симпласты образовывали рыхлые скопления, в которых они были ориентированы параллельно друг другу; встречались разветвленные многоядерные структуры - вероятно, результат слияния нескольких симпластов. Наблюдаемые структуры были морфологически подобны миотубам, формирующимся в процессе мышечной дифференцировки in vitro [5, 6], экс-прессировали активность щелочной фосфатазы -фермента, присутствующего также и в скелетных мышцах крысы [7].
По предварительным данным, покрытие культуральной посуды фибронектином повышало частоту образования симпластов, вероят-
но, за счет более эффективного прикрепления миогенных клеток, которые, как известно, малоадгезивны к пластику [6]. Кроме того, усиленная дифференцировка отмечалась в культуральной среде БМЕМ, вероятно, высокое содержание в ней кальция способствовало слиянию миобластов. При посеве клеток печени 17-суточных плодов на покрытую фибронектином 12-луночную плату в этой среде мы наблюдали не только появление большого числа симпластов во всех лунках, но и спонтанное сокращение некоторых из них. Многоядерные клетки появлялись уже после 5 сут культивирования; через 7 сут в культурах присутствовали скопления крупных симпластов с десятками ядер, а еще через трое суток - сокращающиеся структуры. Мышечная природа симпластов была подтверждена иммуногистохимической реакцией на десмин и миозин. Десмин выявлялся как в некоторых одноядерных клетках, так и в
Рис. 1. Миотубоподобные симпласты в первичной культуре печени 16-суточных плодов крысы. Окрашивание азуром-эозином.
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской Академии наук, Москва
СПОНТАННЫЙ МИОГЕНЕЗ В ПЕРВИЧНОЙ КУЛЬТУРЕ
121
*
(б)
Рис. 2. Окрашивание культуры печени 17-суточных плодов моноклональными антителами: а - к десмину (клон Б33, "ЛЬеаш", Великобритания); б - к миозину (клон МУ-32, "ЛЬеаш").
миотубах, чаще небольших, а миозин - как правило, в крупных вытянутых симпластах (рис. 2).
Для проверки предположения о связи миогене-за с возможным загрязнением культуры миобла-стами из скелетных мышц мы поместили в те же условия суспензию клеток эмбриональной ткани из области бедра и спины, а также их смесь с клетками печени в соотношении 1 : 100 (табл. 1). Клетки культивировали на 12-луночных платах, покрытых фибронектином, в течение 10 сут. В культуре клеток из бедра и спины доля миотуб в пересчете на общее число посаженных клеток была очень высока, однако они обычно имели небольшой размер и не образовывали крупных скоплений. В них выявлялся десмин, что говорило о присутствии клеток на ранних стадиях миогенеза, но отчетливая реакция на миозин отсутствовала. Возможно, слабая выраженность дифференцировки была связана с низкой плотностью посева, затрудняющей слияние клеток. В смешанной культуре примесь клеток из мышц не усиливала мио-генез, что позволяет исключить предположение о трофическом или индукционном влиянии клеток печени на привносимые извне миобласты. По количеству, морфологии и иммуногистохимиче-ским свойствам миотуб эта культура была сходна с культурой клеток печени. Результаты свидетельствуют о том, что миогенез в культуре клеток печени, по-видимому, не связан с контаминацией клетками из окружающих тканей.
Возникает вопрос, является ли образование миосимпластов следствием дифференцировки
мультипотентных МСК. Способность к образованию скелетных мышц под действием различных индукторов была неоднократно показана для МСК не только из печени, но и из других тканей [5, 8-10]. Однако мы никогда не обнаруживали миогенеза в культурах костного мозга - наиболее известного источника МСК. Кроме того, образование миотуб клетками эмбриональной печени в большинстве случаев наблюдали в первичной культуре, представляющей собой гетерогенную клеточную популяцию; в пассируемых культурах МСК спонтанное образование подобных структур было отмечено лишь в одном из многих экспериментов (рис. 3). Миогенную дифференциров-ку клеток эмбриональной печени четвертого пассажа нам не удалось вызвать и воздействием 5-азацитидина, известного как индуктор миогенеза в культурах МСК [2, 3, 8]. Не исключено, что предшественниками выявляемых нами миотуб являются не МСК, а коммитированные миоген-ные клетки. Подобные клетки, экспрессирующие маркеры миогенеза и способные к образованию симпластов in vitro, обнаружены в различных органах плода цыпленка, в том числе и в печени [11], а также в первичной (но не в пассируемой) культуре стромы жировой ткани мыши [6]. Возможно, подобные клетки обеспечивали миогенез и в наших культурах, вступая в дифференцировку после изъятия из микроокружения печени. Выяснение вопросов о природе миогенных клеток в эмбриональной печени, об их судьбе в ходе эмбриогенеза и возможном присутствии в других тканях, а также детальная характеристика обра-
Таблица 1. Число миотуб в культурах клеток 17-суточных плодов крысы
Источник клеток и плотность посева Среднее число миотуб на лунку Среднее число миотуб на 1 ■ 106 посаженных клеток
Печень (1 ■ 106 клеток/мл) 119.17 ± 8.00 59.59 ± 4.00
Ткань бедра и спины (1 ■ 104 клеток/мл) 28.83 ± 4.88 1442 ± 244
Печень (5 ■ 105 клеток/мл) + ткань бедра 47.17 ± 5.15 46.70 ± 5.10
и спины (5 ■ 103 клеток/мл)
122
ПАЮШИНА и др.
Рис. 3. Прижизненная микрофотография симпластов в культуре МСК из печени 16-суточных плодов (четвертый пассаж).
зуемой ими мышечной ткани будут предметом дальнейших исследований.
Работа поддержана РФФИ (грант 06-0448209) и грантом Президента РФ "Ведущие научные школы" (НШ-1134.2008.4).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Campagnoli C, Roberts AG., Kumar S. et al. // Blood. 2001. V. 98. № 8. P. 2396-2402.
2. Krupnick A.S., Balsara K.R., Kreisel D. et al. // Tissue Eng. 2004. V. 10. № 5/6. P. 723-735.
3. Gornostaeva S.N., Rzhaninova A.A., Gold'stein D.V. // Bull. Exp. Biol. and Med. 2006. V. 141. № 4. P. 493499.
4. Machaj E.K., Grabowska I, Gajkowska A. et al. // Folia histochem. et cytobiol. 2005. V. 43. № 4. P. 217-222.
5. Phinney D.G., Kopen G, Isaacson R.L., Prockop D.J. // J. Cell Biochem. 1999. V. 72. № 4. P. 570-585.
6. Di Rocco G, Iachininoto M.G., Tritarelli A. et al. // J. Cell Sci. 2006. V. 119. P. 2945-2952.
7. Safadi A., Livne E, Reznick A.Z. // Arch. Gerontol. and Geriatr. 1997. V. 24. P. 183-196.
8. Wakitani S., Saito T., Caplan A.I. // Muscle Nerve. 1995. V. 18. № 12. P. 1417-1426.
9. Mizuno H, Zuk P.A., Zhu M. et al. // Plast. Reconstr. Surg. 2002. V. 109. № 1. P. 199-209.
10. Gang E.J., Jeong J.A., Hong S.H. et al. // Stem Cells. 2004. V. 22. P. 617-624.
11. Gerhart J, Bast B., Neely C. et al. // J. Cell Biol. 2001. V. 155. № 3. P. 381-391.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.