научная статья по теме СПОСОБНОСТЬ К РОСТУ ЗАРОДЫШЕВЫХ ОСЕЙ, ИЗОЛИРОВАННЫХ ИЗ ПОКОЯЩИХСЯ И ПРОРАСТАЮЩИХ СЕМЯН КОНСКОГО КАШТАНА, И ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННОЙ АБК Биология

Текст научной статьи на тему «СПОСОБНОСТЬ К РОСТУ ЗАРОДЫШЕВЫХ ОСЕЙ, ИЗОЛИРОВАННЫХ ИЗ ПОКОЯЩИХСЯ И ПРОРАСТАЮЩИХ СЕМЯН КОНСКОГО КАШТАНА, И ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННОЙ АБК»

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 1, с. 86-98

УДК 581.1

СПОСОБНОСТЬ К РОСТУ ЗАРОДЫШЕВЫХ ОСЕЙ, ИЗОЛИРОВАННЫХ ИЗ ПОКОЯЩИХСЯ И ПРОРАСТАЮЩИХ СЕМЯН КОНСКОГО КАШТАНА, И ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННОЙ АБК

© 2004 г. Н. А. Гумилевская, М. И. Азаркович*

Институт биохимии им. А. Н. Баха Российской академии наук, Москва *Институт физиологии растений им. К. А. Тимирязева Российской академии наук, Москва

Поступила в редакцию 20.05.2003 г.

Исследована способность к росту отделенных от семядолей осевых органов из зрелых семян конского каштана (Aesculus hippocastanum L.), как свежесобранных, так и подвергнутых холодной стратификации. Показано, что изолированные зародышевые оси, инкубированные в темноте при 28°С на воде в течение 3 сут, претерпевали в ходе выращивания in vitro существенное увеличение сырого веса и размеров, изменения в полипептидном составе растворимых белков, снижение содержания ряда термостабильных полипептидов и сохранение способности синтезировать белки in vivo. Аналогичные изменения происходили в осевых органах интактных семян во время стратификации вплоть до их проклевывания. Рост изолированных осей ускорялся с увеличением продолжительности стратификации семян, подавлялся циклогексимидом (50 мкг/мл) и а-аманитином (7 мкг/мл), но был нечувствителен к ингибитору синтеза АБК флуридону (5 мкг/мл) и природному цитокинину ди-гидрозеатину (10-5 М). Способность к росту у зародышевых осей, изолированных из покоящихся и прорастающих семян конского каштана, указывает на отсутствие собственного покоя у осевых органов зрелых семян. Рост осей, выделенных из стратифицируемых, но не проклюнувшихся семян, полностью подавлялся экзогенной АБК (10-5 М), но снижения уровня белкового синтеза при этом не происходило. Оси, выделенные из проклюнувшихся семян, не чувствительны к АБК и интенсивно растут в ее присутствии. Предполагается, что ингибирование АБК роста изолированных осевых органов может быть связано как с подавлением синтеза минорных полипептидов, необходимых для роста, так и с активацией синтеза белков, ингибирующих рост. Сделано заключение о возможности использования изолированных осей как модельной системы для изучения регуляции начального этапа (инициации) прорастания рекальцитрантных семян.

Aesculus hippocastanum - семена - белки - глубокий покой - прорастание - АБК - способность к росту - зародышевые оси

Зрелые свежесобранные семена конского каштана обладают двумя физиологическими особенностями. Они сохраняют высокую влажность и не переносят высыхания, т.е. относятся к ре-кальцитрантному типу семян. Помимо этого семена конского каштана плохо прорастают без предварительной длительной холодной обработки (стратификации), т.е. находятся в состоянии глубокого покоя [1-4]. Молекулярные механизмы индукции, поддержания и преодоления глубокого покоя у рекальцитрантных семян изучены мало и пока остаются неясными. Процесс выхода из покоя семян конского каштана обнаруживает сложную картину температурной зависимости.

Сокращения: ДГЗ - дигидрозеатин; ФМСФ - фенилметил-сульфонилфторид; ЦГ - циклогексимид. Адрес для корреспонденции: Гумилевская Наталия Александровна. 119071 Москва, Ленинский просп., 33. Институт биохимии РАН. Факс: 07(095) 954-27-32; электронная почта: obroucheva@ippras.ru

Чем продолжительнее холодная стратификация, тем ниже становится температура, разрешающая прорастание, и шире его температурные пределы, а чем короче стратификация, тем более высокие температуры требуются для прорастания. После длительной холодной стратификации (около 100 сут) семена конского каштана быстро прорастают при любой положительной температуре ниже 36°С, и даже сама температура стратификации становится пригодной для прорастания [5]. В ходе холодной стратификации семена конского каштана постепенно выходят из покоя [5], и, вероятно, этот процесс регулируется цитокини-нами [4].

Имеются данные о том, что покой у семян конского каштана обусловлен покоем самого зародыша, а не инициирован семенной кожурой, поскольку интактные семена и семена с удаленной семенной кожурой, т.е. зародыши, прорастают сходным образом [2, 5]. По другим данным, роль семенной кожуры весьма существенна, и ее вклад

является основным на протяжении всей стратификации, а покой самого зародыша сохраняется только в первой половине периода стратификации [6]. Покой зародыша может быть следствием собственного покоя зародышевой оси, а может быть результатом воздействия семядолей. Инги-бирующее действие семядолей на рост зародышевой оси показано на семенах лещины Corylus avellana [7], клена Acer saccharum [8] и других видов ортодоксальных семян, для выхода из покоя нуждающихся в холодной стратификации [9]. Предполагается, что в ходе холодной стратификации ингибирующее действие семядолей каким-то образом снимается, и это может быть связано с репрессией синтеза определенных белков в семядолях [10]. В семенах подсолнечника Helianthus an-nuus [11], как и в семенах клена татарского A. tataricum [12], оси сами находятся в состоянии покоя, и удаление семядолей не влияет на их физиологическое поведение. Для семян конского каштана вопрос о взаимодействии осей и семядолей в поддержании покоя зародыша пока остается открытым.

Известно, что важную роль в физиологии семян играет АБК [13]. На семенах подсолнечника [11, 14], бука [15], пшеницы [16] и ячменя [17], относящихся к ортодоксальному типу и имеющих разные виды покоя, показано, что синтез эндогенной АБК в самих зародышах при созревании семян ответственен за индукцию покоя, и глубина индуцируемого покоя коррелирует с активностью синтеза АБК.

Относительно механизмов регуляции покоя семян было постулировано, что для поддержания покоя необходим синтез специфических белков и что прекращение синтеза этих белков инициирует выход из покоя [8, 18, 19]. Предполагается, что роль АБК в поддержании покоя состоит в индукции генов таких белков, участвующих в блокировании прорастания [20-23]. Если эндогенная АБК участвует в индукции и поддержании покоя зародыша, то экзогенная АБК способна подавлять прорастание семян, находящихся в состоянии вынужденного покоя [24, 25]. Механизм действия АБК на прорастание семян с вынужденным покоем пока неясен.

В отличие от ортодоксальных семян, физиологические и биохимические изменения в зародышах, связанные с индукцией покоя, его поддержанием и преодолением при стратификации у ре-кальцитрантных семян с глубоким покоем, пока изучены очень мало.

Ранее мы охарактеризовали белки [26] и белок-синтезирующую активность осевых органов покоящихся и прорастающих семян конского каштана [27].

В данной работе мы попытались выяснить, обладают ли оси зрелых покоящихся рекальцит-

рантных семян конского каштана собственным покоем и как влияют экзогенная АБК и холодная стратификация на поведение изолированных осей при их культивировании на воде при 28°С. В задачу работы входило: 1) охарактеризовать картину физиологических и биохимических изменений в осях, отделенных от семядолей и выращиваемых in vitro при 28°С, в сравнении с изменениями, происходящими в осях интактных семян на этапах, предшествующих прорастанию, 2) исследовать действие экзогенной АБК, а также цито-кининов и ингибиторов синтеза белка и РНК на поведение изолированных осей, выращиваемых in vitro.

МЕТОДИКА

Семена конского каштана (Aesculus hippoc-astanum L.), собирали после опадения в 1999 г. в дендропарке Могилева (Беларусь) и в парках Москвы в 2000 и 2001 гг. В работе использовали как свежесобранные семена, так и стратифицированные во влажном песке при 5°С в темноте. В этих условиях семена проклевывались через 1820 нед. Периодический отбор семян для анализов по ходу стратификации проводили, как описано нами ранее [26, 27]. Семена каждого года урожая анализировали раздельно. Оси отделяли вручную с помощью скальпеля и сразу использовали для анализа.

Рост изолированных осей. Порции неповрежденных изолированных осей примерно одинаковой величины взвешивали, измеряли длину каждой оси и по 20 осей помещали в стерильные чашки Петри (диаметром 10 см) с 10 мл стерилизованной бидистиллированной воды, содержащей хлорам-феникол (50 мкг/мл). В другие пробы добавляли одно из следующих соединений: циклогексимид (ЦГ, 50 мкг/мл), а-аманитин (7 мкг/мл), дигидро-зеатин (ДГЗ, 10-5 М), АБК (10-5 М), флуридон (5 мкг/мл). Оси инкубировали в темноте при 28°С в течение 3 сут. Каждые сутки оси обсушивали фильтровальной бумагой, измеряли длину каждой оси, взвешивали всю порцию и отбирали по 5 осей для опыта по импульсному мечению in vivo белков осей 358-метионином.

Мечение in vivo белков изолированных осей проводили, как описано ранее [27]. По 5 осей инкубировали в течение 4 ч при 28°С в темноте в капле инкубационной среды (0.25 мл), нанесенной на кусочек парафильма, в чашках Петри (диаметром 2.5 см), прикрытых крышками. Инкубационная среда содержала бидистиллированную воду, 358-метионин (100 мкКи/мл) и хлорамфени-кол (50 мкг/мл). В отдельных пробах присутствовало одно из соединений, которые использовались при выращивании осей. После окончания времени мечения оси отмывали холодной водой

(0.5 л) и 0.1%-ным раствором L-метионина, после чего замораживали.

Экстракция белка. Замороженные оси (5 шт.) гомогенизировали в ступке и стеклянном гомогенизаторе с 10 мл 0.25 М сахарозы, приготовленной на 0.05 М Трис-НС1-буфере (рН 7.2), содержащем 0.01 М Mg-ацетата, 0.025 M KCl и 1 мМ фе-нилметилсульфонилфторида (ФМСФ). Гомогенат центрифугировали при 1000 g в течение 10 мин. Аликвоты надосадочной жидкости использовали как источник суммарного белка осей, остальной экстракт центрифугировали при 20000 g в течение 20 мин. Аликвоты постмитохондриального экстракта использовали как источник растворимых белков осей. Остальной экстракт прогревали 5 мин при 75°С для разделения термостабильных и термолабильных растворимых белков осей. Коагулировавшие термолабильные белки удаляли центрифугированием, а из надосадочной жидкости осаждали термостабильные белки с помощью ТХУ (конечная концентрация 10%). Препараты белка для электрофореза и измерения включения 358-метионина готовили из ТХУ-осажденных проб [27]. Т

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком