Юрков А.П., кандидат биологических наук, научный сотрудник Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии, доцент Российского государственного гидрометеорологического университета Якоби Л.М., научный сотрудник Румянцева М.Л., кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник (Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии) Степанова Г.В., кандидат сельскохозяйственных наук, зав. лабораторией селекционных симбиотических технологий Всероссийского института кормов им. В.Р. Вильямса Россельхоза-кадемии
СПОСОБНОСТЬ МУТАНТОВ ЛИНИИ MLS-1 ЛЮЦЕРНЫ ХМЕЛЕВИДНОЙ К ФОРМИРОВАНИЮ СИМБИОЗА С КЛУБЕНЬКОВЫМИ БАКТЕРИЯМИ1
С применением этилметансульфоната (ЭМС) проведен мутагенез облигатно микотрофной линии MlS-1 люцерны хмелевидной, имеющей признаки карликовости без арбускулярной микоризы (АМ) на почве с низким содержанием доступного для питания растений фосфора. Анализ полученных мутантов показал, что мутанты с Myc-- и PerT-фенотипом неспособны к формированию симбиоза с клубеньковыми бактериями. Мутант c Rmd-фенотипом оказался способным к формированию симбиоза с ризобиями. Таким образом, получена новая линия растения, имеющая нарушения в генах, от-вественных за формирование эффективного микоризного симбиоза, но не имеющая отклонений в развитии бобово-ризобиального симбиоза.
Ключевые слова: арбускулярная микориза, люцерна хмелевидная, Glomus irtraradices, клубеньковые бактерии, ЭМС-мутанегез.
THE CAPACITY OF BLACK MEDIC MLS-1 LINE MUTANTS TO FORM SYMBIOSIS WITH NODULE BACTERIA
The mutagenesis of obligate mycotrophic black medic MlS-1 lire characterized by dwarf symptom without arbuscular mycorrhiza (AM) under condition of low level of available phosphorus ir soil was carried out by ethylmetanesulfonate. The analysis of selected plant mutants shows that Myc-- и Pen--phenotype mutants were disabled to form symbiosis with root nodulated bacteria. Mutant with Rmd--phenotype is able to form symbiosis with rhizobia. That indicates we obtain new plant line with defects in genes, controlling formation of effective mycorrhizal symbiosis, but which without defects in rhizobium-legume symbiosis development.
Keywords: arbuscular mycorrhiza, black medic, Glomus intraradices, root nodule bacteria, EMS-mutagenesis.
Введение. Большая часть наземных растений образуют арбускулярную микоризу (АМ), вступая в ассоциацию с грибами типа Glomeromycota (Renker et al., 2003). АМ способствует улучшению минерального питания растений, особенно фосфорного, что имеет большое значение для выживания растений в естественных природных условиях (Smith, Read, 2008).
i
© А.П. Юрков, Л.М. Якоби, 2012 г.
Особое внимание в настоящее время уделяется экологической эффективности АМ сельскохозяйственных растений, как одному из факторов повышения их продуктивности. Для изучения механизмов, управляющих эффективностью АМ, авторами был проведен отбор сильно микотрофной линии MlS-1 на основе сорто-популяции ВИК32. люцерны хмелевидной (Medi-cago lupulina L. var. vulgaris Koch) с последующим мутагенезом. В условиях низкого уровня фосфора (Рд) в почве, доступного для питания растений, и в отсутствии инокуляции АМ-грибом M. lupulina имеет признаки карликовости, тогда как при инокуляции АМ-грибом ее продуктивность увеличивается на порядки (Юрков и др., 2010; Юрков, Якоби, 2011). Это позволяет оценивать симбиотическую эффективность формируемой АМ по показателям продуктивности растения. В результате ЭМС-мутагенеза получен ряд морфологических мутантов, включая симбиотические (нарушения в развитии микоризы), а также мутанты, имеющие отклонения в сторону ускорения или замедления развития АМ. Цель настоящего исследования - оценка способности мутантов линии MlS-1 люцерны хмелевидной к формированию симбиоза с клубеньковыми бактериями. Эти данные позволят ответить на вопрос, имеются ли общие нарушения в становлении и развитии микоризного и бобово-ризобиального симбиоза у полученных мутантов.
Материалы и методы. Растительный материал. В качестве исходной (контрольной) растительной линии взята облигатно микотрофная линия MlS-1 M. lupulina, что дает возможность использовать показатели роста растений в качестве признаков, характеризующих симбиотическую эффективность АМ и проводить сравнительный анализ мутантов с отклонениями в развитии АМ по фенотипическим признакам. Помимо MlS-1 также взята двулетняя линия Pav19 с целью выявления специфичности взаимодействия ризобий с растением-хозяином. Были изучены следующие мутанты: III-8-20-23-2-2-3 (с My^-фенотипом); XII-32-3-10-4-2-8, XII-32-5-50-2-3-5 и XII-32-6-45-2-2-7 (с Реп-фенотипом); XII-2-18-4-5-9-1 (с Rmd-фенотипом).
Используемые штаммы ризобий и условия микровегетационного эксперимента. Микровегетационный метод выращивания растений с визуальной оценкой состояния клубеньков необходим для оценки способности мутантов растений вступать в симбиоз с ризобиальными бактериями. Выращивание растений проведено на вермикулите с добавлением питательного раствора, в состав которого входят макро- и микроэлементы, согласно прописи Красильни-кова и Кореняко (1940). Для анализа взяты ризобиальные клубеньковые бактерии специфичные для M. lupulina. Оценка специфичности ризобиальных штаммов проведена на исходной для мутантов однолетней линии MlS-1 дикого типа (фенотипическое описание линии дано в статье [Юрков, Якоби, 2011]), а также двулетней линии люцерны хмелевидной Pav19, полученной ранее в исследованиях А.П. Юркова с соавт. (характеристика линии дана в статье [Юрков с соавт., 2011]). Однолетняя (MlS-1) и двухлетняя (Pav19) линии люцерны хмеле-видной были высажены в сосудах на различных дерновоподзолистых, среднеокультуренных почвах, взятых из регионов Ленинградской области. Ризобии выделяли общепринятым способом из розовых клубеньков, собранных с корней люцерны [Румянцева и др., 2011]. Полученные бесцветные, слизистые колонии переносили в пробирки на косяки с бобовым агаром для хранения и инокуляции. Проведена проверка вирулентности природных изолятов клубеньковых бактерий на однолетней люцерне хмелевидной. Повторность: трехкратная, по 2 проростка в пробирке. Вегетация: 65 сут. Для проверки вирулентности помимо выделенных бактерий взяты лабораторные штаммы из коллекции ГНУ ВНИИСХМ Россельхозакаде-мии, такие как: шт. RCAM01775 (лабораторное название - шт. А1), RCAM01760, RCAM01761 и RCAM01723. Штамм RCAM01775, а также изоляты, выделенные с однолет-ный люцерны (изолят №3) и с двулетней люцерны (изолят №2), образовали в среднем 2-4 розовых клубенька на 1 растении длиной 1-2 мм. При инокуляции прочими изолятами и штаммами клубеньки на однолетней люцерне хмелевидной не формировались.
Основываясь на полученных результатах предварительного анализа, были отобраны следующие эффективные штаммы для оценки клубенькообразования мутантных линий люцерны: (1) эффективный штамм RCAM01775 Sinorhizobium meliloti, выделенный с засолённых почв Приаралья на однолетней люцерне хмелевидной (M lupulina L.); (2) штамм №3, изолированный из почвенного образца Ленинградской области при выращивании на линии MlS-1 однолетней люцерны хмелевидной. Подобран состав смеси для микровегетационных опытов в пробирках на анализ клубенькообразования: кварцевый песок: слабоокультуренная почва: вспученный вермикулит = 74 : 25 : 1 по весу, pH = 7,08. Условия эксперимента оптимальны для развития растений и позволяют избежать спонтанного заражения ризобиями и иными симбио-тическими микроорганизмами. Перед проращиванием семена очищали от створок, стерилизовали концентрированной серной кислотой в течение 7 мин и промывали стерилизованной водой. Проращивание проводили на влажной стерилизованной фильтровальной бумаге в чашках Петри при температуре +27°С. Проростки мутагенизированных растений высаживали в стеклянные стерильные пробирки с 25 г субстрата по одному на пробирку и выращивали в стерилизованном ультрафиолетом (до постановки опыта) световом боксе. Режим смены дня и ночи: 18 ч и 6 ч, соответственно. В качестве контроля высаживали проростки исходной линии MlS-1 и линии Pav19 с инокуляцией и без инокуляции ризобиями. Растения выращивали при искусственном освещении и температуре +25-26°С. Фенотипический анализ растений проводили на 60-е сут от посадки (в фазу розетки - начала стеблевания растений). Определяли особенности фенотипа растений и клубенькообразования. Биологическая повторность - 15 растений.
Результаты и обсуждение. Проанализировано образование клубеньков у 5 мутантных линий, линий MlS-1 и Pav19 со штаммами, показавшими в предварительных экспериментах способность к формированию эффективного бобово-ризобиального симбиоза с линиями MlS-1 и Pav19 (штаммы А1 и №3). Результаты анализа показателей роста, развития и клу-бенькообразования у мутантных линий и дикого типа люцерны хмелевидной приведены в таблице. Показано, что мутанты с Myc- и Pen-фенотипом (III-8-20-23-2-2-3, XII-32-3-10-4-2-8, XII-32-5-50-2-3-5, XII-32-6-45-2-2-7) не образовали клубеньков, как со штаммом RCAM01775, так и со штаммом №3. Это свидетельствует о полигенном контроле становления микоризного и ризобиального симбиозов. С другой стороны растения XII-2-18-4-5-9-1 (c Rmd-фенотипом) образовали как розовые, так и белые клубеньки различных размеров, как при инокуляции штаммом RCAM01775, так и при инокуляции штаммом №3. Число эффективных розовых клубеньков у этой мутантной линии совпадало с числом таковых у дикого типа - линии MlS-1. Это означало, что линия растения XII-2-18-4-5-9-1 имела нарушения в генах, ответственных за формирование эффективного микоризного симбиоза, но не имела отклонений в развитии бобово-ризобиального симбиоза.
Инокуляция ризобиями не оказывала существенного влияния на показатели роста и развития мутантной линии c Rmd--фенотипом, характеризующейся аморфными арбускулами при микоризации и извилистым стеблем. Инокуляция двулетней люцерны Pav19 проходила более эффективно с применением селектированного в рамках проекта штамма №3, чем инокуляция штаммом RCAM01775, о чем свидетельствует со
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.