научная статья по теме СРАВНЕНИЕ РЕДОКС-СТАТУСА КЛЕТОК МОРФОГЕННЫХ И ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ НИХ НЕМОРФОГЕННЫХ КАЛЛУСОВ ГРЕЧИХИ ТАТАРСКОЙ Химия

Текст научной статьи на тему «СРАВНЕНИЕ РЕДОКС-СТАТУСА КЛЕТОК МОРФОГЕННЫХ И ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ НИХ НЕМОРФОГЕННЫХ КАЛЛУСОВ ГРЕЧИХИ ТАТАРСКОЙ»

БИОХИМИЯ, 2009, том 74, вып. 6, с. 842 - 852

УДК 577.152.1

СРАВНЕНИЕ РЕДОКС-СТАТУСА КЛЕТОК МОРФОГЕННЫХ И ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ НИХ НЕМОРФОГЕННЫХ КАЛЛУСОВ ГРЕЧИХИ ТАТАРСКОЙ

© 2009 г. Г.В. Камалова*, А.Н. Акулов, Н.И. Румянцева

Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН, 420111 Казань, ул. Лобачевского, 2/31; факс: (843) 292-7347, электронная почта: kam-guz@yandex.ru

Поступила в редакцию 25.04.08 После доработки 19.11.08

Исследовали внутриклеточное содержание перекиси водорода и продукта перекисного окисления липидов — малонового диальдегида, а также активность антиоксидантных ферментов: каталазы, аскорбатпероксидазы и супероксиддисмутазы в клетках морфогенных и полученных из них неморфогенных каллусов гречихи татарской. Было установлено, что неморфогенные каллусы характеризовались значительно более высоким содержанием перекиси водорода и малонового диальдегида, низкой активностью каталазы и высокой активностью супероксиддисмутазы по сравнению с морфогенными культурами. Полученные результаты могут свидетельствовать о том, что клетки неморфогенных каллусов находятся в состоянии постоянного окислительного стресса. Тем не менее пролиферативная активность клеток неморфогенных культур и прирост биомассы были значительно выше по сравнению с клетками морфогенных каллусов. Проводится аналогия между раковыми клетками животных и неморфогенными каллусами растений.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: морфогенный и неморфогенный каллус, перекись водорода, малоновый диальдегид, окислительный стресс, антиоксидантные ферменты.

Одной из главных особенностей культивируемых клеток является их высокая морфологическая и генетическая изменчивость. С одной стороны, такая изменчивость может способствовать появлению мутантов с ценными для селекции свойствами, с другой стороны, накопление с увеличением времени культивирования хромосомных и генных мутаций может обусловливать потерю морфогенной способности культивируемых клеток. Одной из возможных причин нестабильности в культурах клеток растений может быть окислительный стресс, вызываемый условиями культивирования (поранением эксплантов, субоптимальными концентрациями гормонов, их сочетанием, наличием железа и прооксидантов в среде культивирования, осмотическим шоком и другими) [1, 2]. Образование активных форм кислорода (АФК), таких как перекись водорода, супероксид (О"2"), гидроксиль-ный радикал (ОН') и синглетный кислород (1О2), происходит в процессе аэробного метабо-

Принятые сокращения: АФК — активные формы кислорода; МДА — малоновый диальдегид; ПЭКК — проэ-мбриональный клеточный комплекс; ПОЛ — перекисное окисление липидов; СОД — супероксиддисмутаза; РМОТ — фенилметилсульфонилфторид.

* Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.

лизма клетки. Будучи высоко реакционноспо-собными, АФК могут реагировать с различными макромолекулами, вызывая их повреждения. Изменения в составе нуклеиновых кислот, не удаленные репарацией, могут быть закреплены в ходе репликации и, в конечном счете, реализованы в виде генных или хромосомных мутаций. Для защиты от повреждающего действия АФК клетки растений используют различные антиок-сидантные системы. К ним относятся неферментативные антиоксиданты, такие как аскор-бат, глутатион, токоферол, различные феноль-ные соединения, а также антиоксидантные ферменты, среди которых основными являются ка-талаза, супероксиддисмутаза (СОД) и аскорбат-пероксидаза [3]. Однако известно, что АФК могут служить сигнальными молекулами и необходимы для запуска ряда метаболических процессов [4]. Поэтому в работе Слезак с соавт. [5] сделан вывод, что антиоксидантная защитная система растений настроена больше на контроль клеточного редокс-статуса, чем на полное удаление АФК.

Тем не менее работы, в которых проводилось бы комплексное изучение влияния про- и анти-оксидантных компонентов клетки на физиоло-го-генетическую стабильность культивируемых клеток, практически отсутствуют. Отчасти это

связано с отсутствием удобных моделей. Одной из немногих работ, посвященных исследованию редокс-статуса в культивируемых клетках с различной способностью к морфогенезу, является работа Косевич с соавт. [6], где в качестве объекта исследований использовали органогенный, неорганогенный и дедифференцированный каллусы сахарной свеклы. Авторами были получены результаты, свидетельствующие о взаимосвязи между морфогенезом in vitro и редокс-статусом клеток.

Морфогенные каллусы гречихи татарской являются уникальной культурой, сохраняющей морфологические, морфогенетические и цито-генетические характеристики в течение длительного времени культивирования (до 10 лет) [7]. Неморфогенные каллусы возникают в этой культуре в виде отдельных очагов и крайне редко (один раз на 30—40 пассажей). Важно отметить, что при формировании рыхлого каллуса на морфогенном каллусе гречихи татарской возможно отобрать новообразованный каллус от родительской культуры и пассировать отдельно. При этом морфогенный каллус не теряет реге-нерационного потенциала, что предоставляет возможность провести сравнительный анализ родительской морфогенной линии и возникающего из нее неморфогенного каллуса. Нами были отобраны четыре неморфогенные линии из четырех различных линий морфогенного каллуса гречихи татарской.

Ранее было показано [8, 9], что в неморфо-генных культурах гречихи татарской содержание внутриклеточной перекиси водорода выше по сравнению с морфогенными культурами. Было сделано предположение, что накопление АФК в клетках неморфогенных культур может быть связано с пониженной активностью антиокси-дантных ферментов. Цель настоящей работы — изучить активность ряда антиоксидантных ферментов (СОД, каталазы и аскорбатпероксида-зы), а также содержание внутриклеточной перекиси водорода и уровень продукта перекисного окисления (ПОЛ) малонового диальдегида (МДА) в морфогенных и отселектированных из них неморфогенных каллусах гречихи татарской.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали каллусы гречихи татарской Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn. Морфо-генные нодулярные каллусы были получены из незрелых зародышей и состояли из проэмбрио-нальных клеточных комплексов (ПЭКК) и участков «мягкого» каллуса; морфология и получение таких культур описаны нами ранее [10,

11]. Основная часть клеток ПЭКК в процессе разрыхления образует «мягкий» каллус, длинные баллонообразные клетки которого имеют слабые межклеточные контакты, сильно лигни-фицированы и не способны к последующему делению [7]. Неморфогенные каллусы были отобраны как клоны, сформированные на морфо-генных каллусах, которые активно делились и отличались по цитолого-биохимическим и морфологическим характеристикам от «мягкого» каллуса [7]. В работе были использованы мор-фогенные линии: 1—5, 1—8, 1—10, 2—6 и полученные из них неморфогенные линии: 1—5р, 1—8р, 1—10р, 2—6р. Каллусные культуры поддерживали в термостате при температуре 26 ± 2° в темноте на каллусогенной среде RX [10], содержавшей минеральные соли среды Гамборга В5 [12] с добавлением 2 мг/л тиамина, 1 мг/л пири-доксина, 1 мг/л никотиновой кислоты, 2 г/л гид-ролизата казеина, 2 мг/л 2,4-дихлорфеноксиук-сусной кислоты, 0,5 мг/л индолилуксусной кислоты, 0,5 мг/л нафтилуксусной кислоты, 0,2 мг/л кинетина. Неморфогенные каллусы пересаживали через каждые две недели, а морфогенные — через каждые четыре недели. Для определения морфогенного потенциала каллусные культуры переносили на безгормональную среду MS [13] и культивировали на свету (5000 Лк) в условиях 16/8-часового фотопериода и температуры 25°. Отмечали способность образовывать соматические зародыши.

Характер роста каллусной культуры оценивали по приросту свежей массы ткани за определенные периоды времени.

Для приготовления цитогенетических препаратов каллус инкубировали в фиксаторе Кларка в течение 4—6 ч. Отмывали материал от фиксатора 96%-ным этанолом и хранили до исследования в 70%-ном этаноле. Окрашивание хромосом проводили 2%-ным пропионовым орсеином («Serva», Германия). Препараты анализировали с помощью микроскопа Jenamed «Саг1 Zeiss» (Германия), фотографировали, используя цифровую камеру Nikon CoolPix 4500, и обрабатывали с помощью программы Adobe PhotoShop 7.0. При определении митотического индекса учитывали не менее 5000 клеток на точку фиксации. Подсчет хромосомных чисел производили не менее, чем на 150 метафазных пластинках с хорошим разбросом хромосом.

Содержание перекиси водорода определяли спектрофотометрически согласно Белинкампи с соавт. [14]. 200—300 мг каллусной ткани растирали с 1—1,5 мл сильно охлажденного ацетона, и полученный гомогенат центрифугировали (5 мин, 12 000 g). Затем отбирали супернатант и использовали для анализа. В пробирки вносили равные объ-

емы полученной вытяжки и реактива, содержавшего: 0,5 мМ FeSO4(NH4)2SO4, 50 мМ ксилено-лового оранжевого («Sigma», США), 200 мМ сор-битола, 50 мМ H2SO4. Измерение поглощения проводили при длине волны 560 нм, используя в качестве контроля смесь, состоявшую из равных частей реактива и чистого растворителя. Содержание перекиси водорода определяли по калибровочной кривой, построенной с использованием известных концентраций перекиси водорода.

Для определения активности каталазы (ЕС 1.11.1.6) использовали спектрофотометрический метод, предложенный Аеби с соавт. [15]. Метод основан на определении скорости разложения перекиси водорода каталазой исследуемого образца с образованием воды и кислорода. Навеску каллусной ткани растирали в охлажденной ступке в 50 мМ фосфатном буфере рН 7,8, содержавшем 1 мМ фенилметилсульфонилфтори-да (PMSF). Гомогенат центрифугировали 5 мин при 12 000 g, затем фильтровали через ультрафильтр «Millipore» с диаметром пор 0,22 мкм. Активность каталазы определяли по изменению поглощения при 240 нм, обусловленному разложением перекиси водорода. Реакционная смесь содержала 2,978 мл буфера (рН 7,0), 0,005 мл экстракта. Реакция запускалась добавлением 0,02 мл 0,6 М перекиси водорода.

За накоплением продукта перекисного окисления липидов — малонового диальдегида — следили по реакции с тиобарбитуровой кислотой [16]. 500 мг каллусной ткани растирали с 1—1,5 мл 1%-ного Тритона Х

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Химия»