КОЛЛОИДНЫЙ ЖУРНАЛ, 2011, том 73, № 4, с. 512-519
УДК 578.226
СРАВНЕНИЕ СТРУКТУРЫ И СВОЙСТВ НУКЛЕОПРОТЕИДОВ, ПОЛУЧЕННЫХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БЕЛКА ОБОЛОЧКИ
ФИТОВИРУСА
© 2011 г. Н. А. Никитин*, А. Д. Сушко**, ***, М. В. Архипенко*, Н. П. Родионова*,
О. В. Карпова*, И. В. Яминский**, ***
* Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет 119991 Москва, Воробьевы горы, 1, стр. 12 **Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, физический факультет 119991 Москва, Воробьевы горы, 1, стр. 2 ***НПП "Центр перспективных технологий", 119311 Москва, ул. Строителей, 4, корп. 5, кв. 47 Поступила в редакцию 21.07.2010 г.
Изучен процесс самосборки вирусоподобных искусственных частиц, состоящих из белка оболочки вируса со спиральной структурой — Х вируса картофеля — и нуклеиновых кислот (РНК и ДНК). Методами просвечивающей электронной микроскопии, атомно-силовой микроскопии и ферментативного анализа исследованы их структура и свойства.
ВВЕДЕНИЕ
Вирусы являются природными нанобиочасти-цами, которые построены из нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК) и многократно повторяющихся белковых молекул, формирующих упорядоченные структуры (капсиды). Вирусы обладают уникальным свойством — способностью к самосборке (реконструкции) вирионов из белка и нуклеиновой кислоты in vitro. При этом вирусные белки могут быть химически модифицированы (введением атомов металла, функционально-активных групп и т.д.). Использование механизмов самосборки вирусных частиц может стать новым подходом к конструированию вирусных наночастиц с заданными полезными свойствами. Искусственные вирусные частицы могут быть использованы для получения магнитных наночастиц, нанопроводников и нано-контейнеров для адресной доставки биологически активных веществ (ферментов, нуклеиновых кислот, неорганических соединений) в клетку.
Впервые возможность самосборки вириона из белка оболочки (БО) и нуклеиновой кислоты была продемонстрирована на примере вируса табачной мозаики (ВТМ) — растительного вируса со спиральной структурой [1], а в дальнейшем подобным образом были реконструированы и другие вирусы [2]. В работе Новикова с соавт. [3] впервые было показано, что аналогичным способом in vitro может быть реконструирован Х-вирус картофеля (ХВК).
ХВК относится к группе потексвирусов (семейство Flexiviridae) и представляет собой гибкие нитевидные вирионы со спиральной структурой, длиной 515 нм и диаметром 13.5 нм. Около 1300 идентичных субъединиц БО формируют полярную спираль ХВК с шагом 3.6 нм. Вирусная РНК заключена между витками этой спирали, каждый виток спирали включает в себя 8—9 субъединиц БО. Частицы имеют полый центральный осевой канал диаметром 3 нм. РНК ХВК содержит 5 генов, 5'-концевой ген РНК кодирует 165-кДа репликазу, а 3'-концевой — БО вируса. Между концевыми генами расположен блок из трех генов, кодирующих три транспортных белка, которые вместе с БО ответственны за транспорт вируса по растению. БО и транспортные белки транслируются с субгеномной РНК [4-6].
Важно отметить, что в отличие от некоторых других потексвирусов (ВМП — вируса мозаики папайи) БО ХВК не способен в отсутствие РНК полимеризо-ваться с образованием частиц, сравнимых по своим размерам с вирионами. БО ХВК способен агрегировать с образованием частиц диаметром 3—4 нм, что соответствует его мономерам и димерам [7, 8].
Процесс самосборки вирусной частицы in vitro происходит при определенных условиях внешней среды (pH, температура, ионная сила), при которых имеет место самоорганизация белковых молекул и нуклеиновой кислоты с образованием нуклеопроте-идной частицы. Реконструированные вирусы, как правило, обладают более высокой инфекционно-
стью, чем свободная нуклеиновая кислота, и по своей структуре близки к нативному вирусу [7, 9, 10].
Показано, что гомологичную вирусную РНК при реконструкции с вирусным БО можно с разной эффективностью заменить другими гетерологич-ными нуклеиновыми кислотами и синтетическими полинуклеотидами. Сборке таких гетерологичных рибонуклеопротеидов (РНП), которые можно назвать искусственными вирусными (вирусоподобными) частицами посвящен ряд работ [10—16]. Ранее были предприняты также попытки получения комплекса ДНК и БО вируса со спиральной симметрией — ВМП [17], но структура и свойства образовавшихся частиц не были подробно исследованы.
Использование вирусов растений для получения искусственных вирусных частиц, в частности, для создания наноконтейнеров для доставки нуклеиновых кислот или других биологически активных веществ является абсолютно биобезопасным подходом, т.к. растения не имеют общих патогенов с человеком. Вирусы растений со спиральной структурой обладают целым рядом характеристик, важных для их использования в качестве основы для конструирования искусственных вирусоподобных частиц с заданными свойствами и как инструментов в нано-биотехнологиях. Это обуславливает следующие возможности: 1) получение меченных металлом на-тивных вирусных частиц; 2) диссоциацию вируса на белок и РНК с последующей реконструкцией — самосборкой частиц, не отличимых от нативного вируса; 3) реконструкцию "смешанных" частиц, содержащих гетерологичную нуклеиновую кислоту; 4) самосборку (реполимеризацию) вирусного БО в отсутствие РНК с образованием частиц, идентичных вирусу по структуре, но не ограниченных по длине; 5) заполнение внутреннего осевого канала спиральных частиц солями металлов для создания нанопроводниковых систем; 6) ориентацию вирусных частиц с образованием анизотропных жидкокристаллических гелей; 7) получение микропа-ракристаллов с использованием препаратов спиральных вирусов или фибриллярных агрегатов вирусного белка [18].
В настоящей работе проведено сравнительное исследование структуры и свойств вирусоподобных наночастиц, состоящих из БО спирального фито-вируса ХВК и гетерологичных нуклеиновых кислот (как РНК, так и ДНК).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Выделение препаратов вируса, вирусных БО и РНК
Препараты ХВК, БО и вирионную РНК выделяли, как описано ранее [10].
Сборка вирусных рибонуклеопротеидов (РНП) in vitro
Для сборки использовали смесь РНК и БО, как описано в [10], в молярном соотношении 1 : 700, которую инкубировали в течение 15 мин в 0.01 М буфере Трис—HCl с pH 7.5—8.0 в объеме 10 мкл при 20°С. Реакцию останавливали добавлением бром-фенолового синего либо охлаждением реакционной смеси до 0°С во льду.
Образование РНП из БО и вирусной РНК выявляли методами просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), атомно-силовой микроскопии (АСМ) и торможения в геле.
Сборка вирусных дезоксирибонуклеопротеидов (ДНП) in vitro
Для сборки ДНП использовали смесь двуцепо-чечной ДНК и БО в молярном соотношении от 1 : 500 до 1 : 1000, которую инкубировали в течение 20 мин в 0.01 М буфере MES с pH от 5.0 до 8.0 в объеме 10 мкл при 20°С. Реакцию останавливали добавлением бромфенолового синего либо охлаждением реакционной смеси до 0°С во льду.
Для получения фрагментов ДНК использовали плазмиду, содержащую полногеномную кДНК-ко-пию генома ХВК [19]. Плазмиду обрабатывали ре-стриктазами HindIll и PstI в буфере "G" (НПО Си-бЭнзим, 10 мМ Трис—HCl с pH 7.6, 10 мМ MgCl2, 50 мМ дитиотриэтола) в течение 1 ч при 37°С. Полученные рестриктные фрагменты анализировали в 1%-ном геле агарозы и выделяли с помощью набора для очистки ДНК фирмы Цитокин. В ходе экспериментов использовали фрагменты различной длины, содержащие 500, 1000, 3000 и 5000 пар нуклеотидов (п. н.).
Образование ДНП выявляли методами ПЭМ, АСМ и торможения в геле.
Атомно-силовая микроскопия
Сканирование проводили на мультимодовом микроскопе с контроллером Nanoscope 3a (Digital Instruments, США) в резонансном режиме на воздухе. Использовали кантилеверы НИИФП fpN01S с резонансной частотой 118—190 кГц и номинальной жесткостью 5.3 Н/м. Типичная амплитуда свободных колебаний кантилевера в резонансе составляла 40 нм. Для обработки и представления АСМ-изоб-ражений использовали программу ФемтоСкан Онлайн. Для приготовления образцов на свежесколо-тую слюду на 5—10 мин наносили 10 мкл исследуемого препарата требуемой концентрации. Затем образец два раза промывали дистиллированной водой и высушивали на воздухе.
1 2 3 4 5 6 7 8
Рис. 1. Результаты электрофоретического анализа комплексов, полученных при инкубации БО ХВК с гомологичной и гетерологичной РНК и ДНК: 1 — РНК ХВК, 2 - гомологичный РНП, 3 - РНК ВТМ, 4 — гетерологичный РНП, 5 — ДНК длиной 3000 п. н., 6 — ДНП из ДНК длиной 3000 п. н., 7 — ДНК длиной 1000 п. н., 8 — ДНП из ДНК длиной 1000 п. н. 1%-ный гель агарозы; окрашивание бромидом этидия.
Просвечивающая электронная микроскопия
Образцы (15 мкл) сорбировали на медных сетках для электронной микроскопии, покрытых формва-ровой пленкой (при нанесении пленки использовали 0.5%-ный раствор формвара в дихлорэтане) в течение 15—20 с, после чего образцы на сетках контрастировали 2%-ным раствором ацетата уранила. Наблюдения проводили на электронном микроскопе LEO-912 АВ.
Обработка белка оболочки ХВК трипсином
К комплексам (РНП или ДНП) добавляли трипсин из расчета 6 нг фермента на 1 мг БО ХВК и инкубировали полученную смесь в 200 мМ Трис—НС1 с рН 8.0 в течение 2 ч при 37°С. Реакцию останавливали добавлением буфера для проведения электрофореза. Полученные пробы анализировали в денатурирующем полиакриламидном геле (ПААГ) по Лэмли [20]. Белки в геле окрашивали кумасси бриллиантовым голубым G-250.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
БО ХВК инкубировали с гомололгичной РНК ХВК, гетерологичной РНК ВТМ и ДНК со случайной последовательностью, полученной при обработке рестриктазами кДНК копии генома ХВК. Инкубированные пробы анализировали методом торможения в геле (рис. 1). При инкубации БО с
РНК и ДНК были получены наночастицы — РНП и ДНП, строение и свойства которых были исследованы с помощью ПЭМ, АСМ и ферментного анализа. При анализе РНП в агарозном геле в неденату-рирующих условиях полоса, соответствующая свободной РНК, уменьшалась, и появлялся набор фрагментов с большей молекулярной массой, соответствующих различным по размерам РНП (рис. 1, дорожка 2). Аналогичный результат был получен при анализе инку
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.