БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2009, том 26, № 1, с. 58-63
УДК 576.314.6.088.6 + 612.11.612.82.015
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КИНЕТИКИ СВЯЗЫВАНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТАГОНИСТОВ ахИ а2-АДРЕНОРЕЦЕПТОРАМИ МЕМБРАН КОРЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС
© 2009 г. Л. А. Нестерова, Б. Н. Манухин
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334, Москва, ул. Вавилова, 26; факс: (095) 8 4991358012, электронная почта: manukhinb@mail.ru
Поступила в редакцию 27.05.2008 г.
На синаптосомальных мембранах головного мозга крыс исследовано связывание специфических неселективных антагонистов а-адренорецепторов [3Н]празозина и а2-адренорецепгоров [3Н]ЯХ821002. Установлено, что для а1-адренорецепторов лиганд-рецепторное взаимодействие соответствует модели: один пул рецепторов и присоединение двух молекул лиганда к одному рецептору. Параметры связывания [3Н]празозина - КА = 1.56 ± 0.17 нМ, Втах = 30.25 ± 1.78 фмоль/мг белка, п = 2. Для а2-адренорецепторов лиганд-рецепторное взаимодействие соответствует той же модели. Параметры связывания [3Н]ЯХ821002 - КА = 1.94 ± 0.08 нМ, Втах = 12.77 ± 3.17 фмоль/мг белка, п = 2. Для своих антагонистов константы диссоциации (К) приблизительно одинаковы (1.56 ± 0.17 и 1.94 ± 0.08 нМ соответственно), а концентрация 02- адренорецепторов в 2 раза ниже (30.25 ± 1.78 и 12.77 ± 3.17 фмоль/мг белка). Эффективность (Е = Втах/2Кд) связывания лиганда а-адренорецепторами различается в 2.3 раза -(7.46 ± 1.32 и 3.29 ± 0.68 фмоль/мг белка/нМ) для а1- и а2-рецепторов соответственно. Предполагается, что а1- и а2-адренорецепторы в мембранах головного мозга крыс существуют в виде димеров.
Норадреналин, нейротрансмиттер симпатической нервной системы, играет ведущую роль в реализации ее пусковой и модуляторной функции. Регуляторное воздействие норадреналина осуществляется путем активации специфических адренорецепторов. В частности, через а-адреноре-цепторы осуществляется регуляция артериального давления, сокращение гладких мышц, регуляция когнитивных процессов и т.д. Выделяют два основных типа а-адренорецепторов - а1 и а2. Рецепторы а1 расположены преимущественно на постсинап-тической мембране, а а2 - как на пре-, так и на пост-снаптической мембранах. Активация пресинапти-ческих а2-адренорецепторов тормозит выход норадреналина из нервных окончаний, что позволяет использовать их агонисты как антигипертензив-ные и седативные препараты. Наибольшая концентрация адренорецепторов находится в ЦНС. Иммуногистохимическими методами [1, 2] и по локализации мРНК [3-6] при гибридизации in situ показано распространение а1- и а2-адренорецепто-ров в различных отделах ЦНС. По определению мРНК выявлена локализация их A, B и C-подтипов [3, 5, 6]. Каждый тип а-адренорецепторов имеет уникальный паттерн распределения в ЦНС. Для а1-адренорецепторов характерны локальные зоны распределения, для а2-адренорецепторов - широкое, диффузное распространение [7].
В настоящей работе представлены количественные характеристики функциональной активности а1- и а2-адренорецепторов мембран коры головного мозга крыс и закономерностей присоединения к ним лигандов.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Опыты проводили на синаптосомах мембран коры головного мозга крыс-самцов линии Вистар (210-250 г), которые выделяли по описанному ранее методу [8] с некоторыми модификациями [9]. Готовые мембранные препараты хранили при -70°С в течение 3 недель. Концентрацию белка определяли по методу Лоури [10], используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин ("Sigma"). Связывание радиоактивного лиганда проводили в инкубационной среде с последующим промыванием мембран от несвязанного лиганда на стеклянных фильтрах GFB по общепринятому методу [11]. Объем инкубационной среды составлял 100 мкл -50 мкл суспензии мембран, 50 мкл 50 мМ буфера трис-HCl, pH 7.4, вытеснитель и радиоактивный лиганд. Реакцию останавливали добавлением 1 мл холодного буфера (0°С). Для определения параметров связывания лиганда с а1-адренорецеп-торами использовали специфический неселективный антагонист а1-адренорецепторов [3Н]празозин ("Amersham", 77 Ки/мМ) в концентрациях 0.33-
6.60 нМ, с Ог-адренорецепторами - специфический антагонист [3И]КХ821002 ("АтегеИат", 50 Ки/мМ), в концентрациях 0.41-4.92 нМ. Специфическое связывание радиоактивных лигандов определяли по разнице между общим и неспецифическим в присутствии нерадиоактивных лигандов ("вытеснителей") празозина для а1-адренорецепторов и рау-вольфсцина для а2-адренорецепторов в концентрациях 100 мкМ. Для определения закономерностей связывания антагонистов со специфическими рецепторами использовали математические и графические методы анализа лиганд-рецепторных взаимодействий.
Ранее на Р-рецепторах нативных эритроцитов изолированных мембран эритроцитов, Р-рецепторах и мускариновых рецепторах мембран коры головного мозга крыс теоретически и экспериментально были обоснованы методы количественного определения основных параметров в радиолиганд-ных реакциях [12, 13]. Показано, что взаимодействие специфических радиоактивных антагонистов Р-адренорецепторов с изолированными мембранами коры мозга крыс описываются уравнениями для одного или двух пулов рецепторов. Действие каждого из исследованных веществ анализировали с использованием семи математических моделей связывания лиганда рецептором [12]. Исходя из этого установлено, что связывание лигандов аг и а2-адренорецепторами мембран коры головного мозга крыс происходит по модели, включающей один пул рецепторов.
Ь = [(ЯтаХА")/( К + А")], (1)
где Ь - количество связанного лиганда, Втах- количество мест связывания лиганда с константой диссоциации КА и коэффициентом Хилла п, [А] - концентрация лиганда в инкубационной среде. Расчет основных параметров лиганд-рецепторного взаимодействия - Кй, Втах, п проводили с помощью компьютерной программы "81§таРкй". Эффективность связывания лигандов с рецепторами оценивали по уравнению:
Е = Втах/2Ка. (2)
Эффективность (Е) - интегральный показатель, количественно характеризующий величину связывания лиганда при его концентрации, равной КА (фмоль/мг белка/нМ) [12]. На рисунках приведены результаты конкретных опытов, а в таблице -средние результаты экспериментов. Теоретические кривые строили по уравнению (1) для одного пула рецепторов. На теоретические кривые нанесены экспериментальные точки. В опытах было по пять-семь точек, каждая с трехкратным повтором. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента (р < 0.05). Все значения представ-
лены как среднее арифметическое и средняя ошибка (M ± sem).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
График специфического связывания [3Н]празо-зина изолированными мембранами коры головного мозга крыс представляет типичную кривую насыщения (рис. 1). Математический анализ экспериментальных данных показал, что наименьшие ошибки параметров и стандартной ошибки вычисления (Standard Error of the Estimate) получены при их расчете по уравнению (1), модели лиганд-рецеп-торного взаимодействия, предполагающей присоединение двух молекул лиганда к одному рецептору и включающей один пул рецепторов (таблица). Графический анализ экспериментальных данных с помощью уравнения (3), линеаризированной формы уравнения (1), в координатах (b; b/A2) также соответствует существованию одного гомогенного пула а1-адренорецепторов (рис. 2).
(b/A2) = [(Bmax)/(К )] - [Ь/(К )]. (3)
Экспериментальные точки на графике расположены на прямой линии. Для подтверждения соответствия полученным данным параметров, рассчитанных по уравнению (1) и (3), построены теоретические кривые, с которыми хорошо совпадают экспериментальные точки (рис. 1 и 2).
Связывание [3H]RX821002 а2-адренорецепто-рами изолированных мембран коры головного мозга крыс также описывается стандартными кривыми насыщения (рис. 3). Математический анализ экспериментальных данных показал, что наименьшие ошибки параметров и стандартной ошибки вычисления получены при их расчете по уравнению (1) и модели связывания - присоединение двух молекул лиганда к рецептору и одного гомогенно-
Параметры связывания [3Н]празозина и [3H]RX821002 аг и а2-адренорецепторами мембран коры головного мозга крыс
Параметры а1-адреноре-цепторы а2-адреноре-цепторы
Kd, нМ 1.56 ± 0.17 1.94 ± 0.08
Bmax, фмоль/мг 30.25 ± 1.78 12.77 ± 3.17
n 2 2
E, фмоль/мг/нМ 7.46 ± 1.32 3.29 ± 0.68
Стандартная ошибка 1.94 ± 0.41 0.57 ± 0.17
вычисления*
Примечание. Kd - константы диссоциации; Bmax - концентрация адренорецепторов; n - коэффициент Хилла; E - эффективность. * Standard Error of the Estimate.
b, фмоль/мг белка
30 -
20 -
10 -
0 2 4 6
А, нМ
Рис. 1. Экспериментальные точки и теоретическая кривая специфического связывания [3Н]празозина а^ адренорецепторами мембран коры головного мозга крыс. По оси абсцисс - концентрация [3Н]празозина (нМ), по оси ординат - количество мест, связанных ли-гандом (Ь, фмоль/мг белка). Теоретическая кривая рассчитана при значениях параметров: Кд = 1.10 нМ, Втах = 30.65 фмоль/мг белка.
b/A2, фмоль/мг/нМ2 25
20
15
10
10 15 20 25 30 35 b, фмоль/мг белка
Рис. 2. Экспериментальные точки и теоретическая кривая специфического связывания [3Ы]празозина a^ адренорецепторами мембран коры головного мозга крыс. По оси абсцисс - количество мест, связанных ли-гандом (b, фмоль/мг белка), по оси ординат - отношение количества мест, связанных лигандом, к квадрату его концентрации (b/A2, фмоль/мг/нМ2).
b, фмоль/мг белка 12
8 -
4 -
10
12 A, нМ
Рис. 3. Экспериментальные точки и теоретическая кривая специфического связывания [3Н]ЯХ821002 а2-адренорецепторами мембран коры головного мозга крыс. По оси абсцисс - концентрация [3Н]ЯХ821002 (нМ), по оси ординат - количество мест, связанных лигандом (Ь, фмоль/мг белка). Теоретическая кривая рассчитана при значениях параметров: Кд = 1.88 нМ, Втах = 12.65 фмоль/мг белка.
b/A2, фмоль/мг/нМ2 4
0 4 8 12
Ь, фмоль/мг белка
Рис. 4. Экспериментальные точки и теоретическая кривая специфического связывания [3Н]ИХ821002 а2-адренорецепторами мембран коры головного мозга крыс. По оси абсцисс - количество мест, связанных лигандом (Ь, фмоль/мг белка), по оси ординат - отношение количества мест, связанных лига
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.