ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2008, том 422, № 2, с. 265-267
КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 591.82:576.536:576.535.5
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ИММУНОФЕНОТИПИЧЕСКАЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕЗЕНХИМНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ИЗ ДЕФИНИТИВНЫХ И ТРАНЗИТОРНЫХ КРОВЕТВОРНЫХ ОРГАНОВ © 2008 г. М. Н. Кожевникова, А. С. Микаелян, В. И. Старостин
Представлено академиком Н.Г. Хрущовым 02.01.2008 г. Поступило 01.02.2008 г.
Костномозговое кроветворное микроокружение организовано мезенхимными стромальными клетками (МСК) с широкими дифференцировоч-ными потенциями [3]. МСК также обнаружены в печени зародышей в период ее функционирования в качестве органа миелоидного кроветворения [1, 4, 5]. Важным критерием МСК является экспрессия специфических поверхностных антигенов CD90, CD73 и CD105 [2].
Цель настоящей работы - сравнительный анализ экспрессии поверхностных антигенов, характеризующих МСК из костного мозга КМ половозрелых крыс и печени зародышей ПЗ, формирующих кроветворное микроокружение миелоидного типа в разные этапы онтогенеза и, возможно, являющихся гистогенетически родственными популяциями. Кроме того, проведена сравнительная оценка остеогенных потенций МСК из названных источников.
МСК выделяли из бедренных и большеберцо-вых костей неинбредных половозрелых крыс Wistar в возрасте 3-5 мес, массой 200-250 г, и печени 16-17-суточных зародышей, используя описанную ранее методику [6]. МСК культивировали по стандартной методике, используя ростовую среду a-MEM ("Sigma") с добавлением 10%-ной сыворотки плодов коровы ("Биолот"). Для индукции остеогенеза клетки культивировали в ростовой среде с добавлением 10-8 M дексаметазона, 50 мкг/мл фосфата аскорбиновой кислоты и 10 мМ Р-глицерофосфата в течение 15-21 сут. Для визуализации минеральных отложений во внеклеточном матриксе клетки окрашивали раствором ализаринового красного S, pH 4.1 ("Sigma"). Антигенный профиль МСК и экспрессию коллагена типа I оценивали с помощью моноклональных антител
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской Академии наук, Москва
к CD90 ("Abcam"), CD73 ("BD Pharmingen"), CD45 ("BioLegend"), CD34 ("Santa Cruz Biotechnology") согласно инструкции фирмы-производителя. Выделение тотальной РНК из МСК осуществляли с помощью реактива TRI Reagent ("Sigma") с последующей обработкой ДНКазой "Турбо" ("Ambion"). Для синтеза кДНК использовали M-MLV-обрат-ную транскриптазу и олиго(дТ)15 ("СилексМ"). ПЦР проводили, применяя специфические праймеры (табл. 1) и ColoredTaq-полимеразы ("СилексМ").
Не выявлена экспрессия общего лейкоцитарного антигена CD45, маркера ранних кроветворных предшественников CD34, антигена В-лимфо-цитов CD19 (рис. 1а). С помощью ПЦР-анализа
Таблица 1. Праймеры, использованные в работе
Ген Нуклеотидная последовательность праймера Размер продукта, н.п.
GAPDH 5 5 -tacaacctccttgcagctcc-3' -ggatcttcagaggtagtctgtc-3' 378
OC 5 5 -agactccggcgctacctcaa-3' -cagctgtgccgtccatactttc-3' 273
Runx2 5 5 -ccgcacgacaaccgcaccat-3' -cgctccggcctacaaatctc-3' 289
ALP 5 5 -tggccctccggatcctgacaaaga-3' -cgccgtgaagcaggtgagccatag-3' 477
CD90 5 5 -gaacccagtcatcagcatcac-3' -gggcccaaccagtcacagag-3' 496
CD73 5 5 -ccgggggccactagcacctca-3' -ggcctggaccacgggaacctt-3' 401
CD 105 5 5 -tccagctgcggcatgaaagtgaca-3' -gagcagggccccaatgaggaagg-3' 553
CD 19 5 5 -tggtttctatggcggcttttctct-3' -acggggtcatcctcagggttctca-3' 415
CD11b 5 5 -gggggcaaggatctcacaatggac-3' -ttaaggcgcaggatgatgggactc-3' 473
266
КОЖЕВНИКОВА и др.
(а)
Пассаж 1 Пассаж 3
МСК КМ
(б)
МСК ПЗ
CD11b
н.п.
473
415 378
473 415 378
Рис. 1. ПЦР-анализ экспрессии генов СО11Ь, СО19 (а); СО73, С090, С0105 (б). Нормировка по ОЛРОИ. Справа обозначены размеры ПЦР-фрагментов в нуклеотидных парах.
CD73 CD 90 CD 105 GAPDH
н.п. 401
496
553
378
ОС-контроль ОС-опыт GAPDH
ОС-контроль ОС-опыт GAPDH
2 сут
5 сут
(а) 8 сут
15 сут
19 сут
н.п.
273
273 378
273 273 378
Рис. 2. ПЦР-анализ экпрессии гена остеокальцина (ОС) по мере увеличения времени культивирования МСК из костного мозга половозрелых крыс и печени зародышей в остеогенной среде. а - экспрессия ОС в популяции МСК из костного мозга; б - экспрессия ОС в популяции МСК из печени зародыша. Нормировка по ОЛРОИ. Справа обозначены размеры ПЦР-фрагментов в нуклеотидных парах.
показано, что в клеточных культурах из костного мозга часть клеток на первом пассаже экспресси-ровали ген маркера моноцитов и макрофагов СОНЬ, однако его экспрессия полностью исчезала при дальнейшем культивировании. В клеточных культурах из печени зародыша изначально экспрессия этого гена была крайне низкой (рис. 1а). Таким образом, популяции МСК из обоих источников не содержали примесей кроветворных и лимфоидных клеток, начиная со второго пассажа. Исследование антигенного профиля МСК с использованием как ПЦР-анализа, так и иммуно-цитохимии выявило в обеих популяциях экспрессию антигенов СБ90, СБ73, СБ105 (рис. 16).
Сравнительный анализ остеогенных потенций МСК из костного мозга и печени зародыша показал, что в стандартной индукционной среде МСК из зародышевой печени обладают крайне низкой способностью к остеогенной дифференцировке в отличие от выраженных остеогенных потенций МСК из костного мозга. Иммуноцитохимически показано возрастание экспрессии коллагена типа I
в культуре МСК из костного мозга в ходе культивирования клеток в индукционной среде по сравнению с контролем. Окрашивание ализариновым красным S выявило участки отложения кальция во внеклеточном матриксе. С помощью ПЦР-анализа было показано, что во всех культурах МСК из костного мозга количество клеток, экс-прессирующих гены раннего маркера остеогенеза Runx2, остеокальцина (OC) и щелочной фосфатазы (ALP), возрастало в ходе культивирования в остеогенной среде по сравнению с контролем, где доля клеток, экспрессирующих остеогенные маркеры, была ниже (рис. 2а).
МСК из зародышевой печени имели неотчетливо выраженные остеогенные потенции в стан-дартой остеогенной среде. Клетки формировали скопления, напоминающие островки остеогенеза. В участках скопления клеток формировался мощный слой межклеточного вещества, основу которого составляли коллагеновые волокона типа I. Однако гистохимически отложения кальция были выявлены только в одном участке. По дан-
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 422 < 2 2008
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ИММУНОФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ...
ным ПЦР-анализа к 15-м суткам инкубации МСК из печени зародыша в остеогенной среде экспрессия ALP и OC снижалась (рис. 26). Динамика экспрессии Runx2 в контроле коррелировала с таковой в опытных образцах. Все вышеизложенные данные однозначно свидетельствуют о принадлежности исследуемых клеточных популяций к МСК, однако их дифференцировочные потенции неодинаковы, что, возможно, связано с различием в программах пре- и постнатального гистогенеза МСК.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект 06-04-48209) и гранта Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология".
267
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Anker P., Noort W, Scherjon S. et al. // Haematologica. 2003. V. 88. P. 845-852.
2. Dominici M, Le Blanc K, Mueller I. et al. // Cytothera-py. 2006. V. 8. P. 315-317.
3. Friedenstein A. J, Gorskaja J. F., Kulagina N. N. // Exp. Hematol. 1976. V. 4. P. 267-274.
4. Gotherstrom C, Ringden O., Westgren M. et al. // Bone Marrow Transplant. 2003. V. 32. P. 265-272.
5. Gotherstrom C, West A., Liden J. et al. // Haematologica. 2005. V. 90. P. 1017-1026.
6. Phinney D, Kopen G, Isaacson R. et al. // J. Cell. Bio-chem. 1999. V. 72. P. 570-585.
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 422 < 2 2008
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.