РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2009, том 49, № 4, с. 425-431
АДАПТИВНЫЙ ОТВЕТ
УДК [57+61]::539.1.04:612.017:616.89
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ АДАПТАЦИИ К ФАКТОРАМ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА У ШТАММА МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА РЛЕС1ШМУСЕ8 ЫЬЛСШШ ИЗ ЗОНЫ ОТЧУЖДЕНИЯ ЧАЭС И ШТАММОВ ТОГО ЖЕ ВИДА, ОБИТАВШИХ НА ТЕРРИТОРИЯХ С ФОНОВЫМ УРОВНЕМ РАДИОАКТИВНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ
© 2009 г. К. Б. Асланиди1, А. Е. Иванова2, Н. Н. Гесслер3, А. С. Егорова2,
Т. А. Белозерская3*
1 Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино 2 Факультет почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова 3 Институт биохимии им. А Н. Баха РАН, Москва
У штамма РаесПошусез Шастш, выделенного из почвы в зоне отчуждения Чернобыльской АЭС (№ 1941), а также штаммов Р. Шастш из почв разных территорий России с фоновым уровнем радиоактивного загрязнения, сравнивали устойчивость к окислительному стрессу. В качестве показателей устойчивости определяли скорости роста и содержание карбонильных групп в белках мицелия грибов, выращенных при разной концентрации глюкозы в среде, а также при действии Н202. Показано, что у штамма из почвы зоны отчуждения ЧАЭС радиальная скорость роста колоний (Кг) в экспоненциальной фазе при исходной концентрации глюкозы в ряду 0.002, 0.2, 0.5, 1.0 и 2.0% была максимальной при 0.2% и в 1.5 раза превышала аналогичный показатель у контрольных штаммов. Выявлена реакция адаптационного торможения роста гиф в первые 10-30 мин действия Н202 (10-5-10-3 моль/л), наиболее ярко выраженная у штамма из зоны отчуждения ЧАЭС (№ 1941). Н202 в концентрации 10-3 моль/л понижал скорость роста штамма № 1941 из зоны ЧАЭС на 20%, в то время как у штамма из почвы с фоновым уровнем радиоактивного загрязнения (№ 10) -полностью. Показано, что у штамма № 1941 из зоны ЧАЭС адаптация к низкому содержанию глюкозы в среде (0.2%) сопряжена с повышенной устойчивостью к факторам окислительного стресса.
Ионизирующая радиация, активные формы кислорода, пероксид водорода, микроскопические грибы, рост, мицелий, адаптация, глюкоза.
Микроскопические грибы обладают высоким потенциалом выживания в экстремальных условиях существования, включая субстратное голодание, изменение влажности, температуры, осмотический стресс, ионизирующее излучение. Разнообразие механизмов антиоксидантной защиты (инактивация АФК, изменение активности метаболических путей, синтез вторичных метаболитов) позволяет клеткам противостоять действию стрессорных факторов [1-3]. Радиационное загрязнение окружающей среды сопряжено с появлением устойчивых к действию ионизирующего излучения организмов и наибольшее разнообразие в этих зонах отмечено для грибов [2, 4].
Длительные исследования морфологических и физиологических характеристик микроскопических грибов из зон с повышенной радиацией вы-
*Адресат для корреспонденции: 119071 Москва, Ленинский просп., 33, Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН; тел.: (495) 952-34-31; факс: (495) 954-27-32; e-mail: tab@inbi.ras.ru.
явили у них ряд особенностей. У штаммов, выделенных из зоны ЧАЭС, облучение стимулировало прорастание спор и последующий направленный к источнику излучения рост гиф по сравнению со штаммами из контрольных зон [5, 6]. Отмечено, что радиоустойчивые штаммы грибов способны существовать в условиях низкого содержания органических веществ [2, 7]. На разных биологических объектах показано, что снижение потребления глюкозы увеличивает продолжительность жизни и повышает устойчивость клеток к окислительному стрессу [8], однако не известно, действует ли подобный механизм при адаптации микроскопических грибов к радиационному излучению.
Механизм повреждающего действия радиации в значительной степени связан с увеличением содержания Н202 в клетках [9]. Показано, что у грибов из зон с повышенной радиацией устойчивость к Н202 повышалась на 1-2 порядка. Отдельные
представители микроскопических грибов из зоны ЧАЭС продолжали расти при концентрации H2O2 10-3-10-2 моль/л [1]. Важную роль в обеспечении устойчивости грибов к образующимся под действием радиации активным формам кислорода (АФК) играет, по-видимому, и наличие пигментов, а также агрегированный рост гиф, выявленный у штаммов из зон с повышенным фоном радиации [1, 2, 7].
P. lilacinus - почвенный гриб, часто обнаруживаемый в местах, подверженных разного рода антропогенным воздействиям, например, загрязненных нефтяными выбросами, сточными водами [10], тяжелыми металлами, кадмием [11], радиоактивными элементами [4]. В настоящее время P. lilacinus наряду с Chaetomium aureum доминирует в почвах с уровнем радиоактивности 3.7 х 106-3.7 х 108 Бк/кг [2].
Цель настоящей работы - выявление особенностей роста на средах с разным содержанием глюкозы и H2O2 микроскопического гриба P. lilacinus, выделенного из почвы зоны отчуждения ЧАЭС (штамм № 1941), в сравнении со штаммами из почв с фоновым уровнем радиоактивного загрязнения. В качестве показателей действия факторов окислительного стресса изучали изменение параметров скорости роста и содержания карбонильных групп в белках.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Для исследования были отобраны штамм P. lilacinus № 1941 из почвы в зоне отчуждения ЧАЭС (дерново-подзолистая почва, Рыжий лес, уровень радиоактивного загрязнения в 1994 г. 3.2 х 107 Бк/кг), а также 5 контрольных штаммов P. lilacinus, выделенных из почв разных географических территорий с фоновым уровнем радиоактивности (плотность поверхностного загрязнения по 137Cs до 1 Ки/км2 (3.7 Бк/см2) [12]: из Москвы (урбано-зем, 2006 г.); республики Тыва (окрестности озера Тере-Холь, перегнойно-гумусовая деструктивная почва, 2007 г.); Тульской обл. (серая лесная почва, 2006 г.); Новгородской обл. (торфяная почва, 2000 г., штамм P. lilacinus № 10) и Ставропольского края (окрестности г. Кисловодска, дерново-карбонатная почва, 2002 г.). Штамм № 1941 был любезно предоставлен для исследования отделом физиологии и систематики микромицетов Института микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболот-ного НАН Украины, прочие штаммы - из рабочей коллекции грибов кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова.
Штаммы поддерживали в пробирках на агари-зованной среде Фогеля в холодильнике. При определении радиальной скорости роста колоний (Kr) пробы каждого штамма засевали уколом на
агаризованную среду Фогеля с различным содержанием глюкозы (по 3 колонии на чашку Петри в 3-кратной повторности чашек). Выращивание штаммов проводили в термостате при 25°C. Изменение диаметра колоний определяли через каждые 12 ч в течение 6 сут.
Влияние H2O2 исследовали по изменению скорости роста гиф штаммов в экспоненциальной фазе (48 ч) роста колоний на агаризованной среде Чапека, покрытой целлофаном, по разработанной ранее методике [1]. Точность измерения роста гиф была ±0.25 мкм/мин. Исследование трендов изменения роста гиф проводили с помощью Microsoft EXCEL. Анализ значимости различий между исследуемыми штаммами в скорости роста колоний в разных условиях культивирования выполнен методом множественного сравнения значений с помощью программы "STATISTICA 6.0".
Для определения содержания карбонильных групп в белках, а также активности супероксид-дисмутазы (СОД) и каталазы штаммы выращивали на агаризованной среде Фогеля с разным содержанием глюкозы до достижения стационарной стадии роста. Определение активности каталазы проводили спектрофотометрически при 240 нм по убыли H2O2 в среде инкубации при исходной его концентрации 8 ммоль/л [13]. Активность СОД в экстрактах мицелия оценивали по ингибированию окисления кверцетина [14]. Определение содержания карбонильных групп в белках основано на реакции с 2,4-динитрофенил-гидразином [15].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Сравнение физиологических параметров роста. Проведенный статистический анализ данных измерения радиальных скоростей роста колоний Kr позволил выделить фазу линейного роста грибов и оценить среднюю радиальную скорость роста колоний в экспоненциальной фазе при каждой исследованной исходной концентрации глюкозы (рис. 1). У штамма P. lilacinus № 1941 при исходной концентрации глюкозы 0.002% наблюдали минимальную скорость роста 0.09 ± 0.01 мм/ч; в диапазоне исходных концентраций глюкозы от 0.5 до 2% Kr возрастала до 0.12 ± ± 0.01 мм/ч; а при концентрации глюкозы 0.2% наблюдали максимальную скорость роста 0.15 ± ± 0.01 мм/ч (различия статистически значимы, p < 0.05)). Kr штаммов из почв с фоновым уровнем радиоактивного загрязнения в экспоненциальной фазе в исследованном диапазоне концентраций глюкозы не изменялись (достоверных различий нет) и были в среднем (0.09-0.1) ± 0.01 мм/ч.
Для штамма P. lilacinus № 1941 из зоны ЧАЭС был характерен более быстрый экспоненциальный рост по сравнению с контрольными штамма-
ми, а также выявлено значительное повышение Кг при исходной концентрации глюкозы в среде 0.2%.
Штаммы из почв с фоновым уровнем радиоактивного загрязнения проявляли сходную динамику роста (значения радиальных скоростей роста колоний этих штаммов при исследованных концентрациях глюкозы существенно не изменялись). Исходя из этого, при изучении действия Н202 на рост в качестве контрольного штамма был взят штамм № 10, выделенный из торфяной почвы Новгородской обл., так как у этого штамма радиальные скорости роста колоний при разных концентрациях глюкозы практически не изменялись.
Скорость роста лидирующих гиф Р. Шастш (штаммы № 1941 и 10) в фазе экспоненциального роста определяли при разной концентрации Н202 (рис. 2, таблица). Было выявлено, что рост гиф контрольного штамма № 10 прекращался при концентрации 10-3 моль/л Н202, тогда как рост штамма № 1941 из зоны ЧАЭС в этих условиях только понижался на 20%. В присутствии 10-2 моль/л Н202 рост штамма № 1941 прекращался, но возобновлялся вновь почти полностью через 5 ч после прекращения действия Н202.
Наиболее интересным представлялось выяснить реакцию адаптации гиф в первые минуты инкубации мицелия с Н202. На рис. 2 представлены линии трендов, отражающие кинетику роста гиф штаммов Р. Шастш 1941 и 10 в присутствии Н202 в концентрациях 10-5, 10-4, 10-3 моль/л. Учитывая, что в экспоненциальной фазе роста колонии гифы растут с постоянной скорост
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.