РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2007, том 1(10), №. 1 с.
— ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ИММУНОМОДУЛЯТИВНЫХ БЕЛКОВ ОРТОПОКСВИРУСОВ
© 2007 г. Т.С. Непомнящих, Илья Викторович Виноградов
ФГУПГосударственный научный центр Вирусологии и биотехнологии "Вектор"
Нами получены препараты рекомбинантных TNF-связывающих белков CrmB вирусов натуральной оспы (VARV), оспы обезьян (MPXV) и оспы коров (CPXV) и рекомбинантных интерферон гамма связывающих белков (IFNyBP) VARV и MPXV. Биологические свойства препаратов CrmB изучали in vitro по их способности нейтрализовать цитотоксические эффекты TNF на культуре L929 мышиных фибробластов. Показано, что рекомбинантные CrmB видоспецифически нейтрализуют цитотоксическое действии человеческого, мышиного, кроличьего TNF, мутеина человеческого TNFR31Q, а также человеческого лимфото-ксина. Показано, что in vitro VARV-CrmB ингибирует цитотоксическое действие человеческого TNF на два порядка более эффективно, чем человеческий рекомбинантный рецептор TNF II ("R&D system"). Биологические свойства препаратов IFNyBP исследовали по их способности in vitro нейтрализовать защитное действие hIFNy от ВЭМКМ на культуре клеток L68 Показано, что рекомбинантные IFNyBP обладают специфической дозозависимой hIFNy нейтрализующей активностью. Биологические свойства препаратов изучали CrmB изучали in vivo на модели LPS-индуцированного септического шока. In vivo VARV-CrmB, но не MPXV-CrmB и CPXV-CrmB увеличивали выживаемость животных в модели LPS-ин-дуцированного септического шока. Гистологическое изучение внутренних органов, брыжейки и головного мозга показало, что белок VARV-CrmB в течение первых 24 ч предупреждает появление инфарктов в сердце, снижает степень нарушений кровообращения в сосудах внутренних органов, головного мозга и брыжейки. В период 24 — 48 ч наблюдается дальнейшая нормализация микроциркуляции и кровоснабжения головного мозга и внутренних органов, не развивается острая почечная недостаточность. Ключевые слова: ортопоксвирусы, фактор некроза опухолей, интерферон
ВВЕДЕНИЕ
Геномы ДНК-содержащих поксвирусов кодируют широкий спектр белковых факторов, которые эффективно нейтрализуют антивирусный ответ организма-хозяина, ингибируя процессы апоптоза, продукцию интерферонов, хемокинов и воспалительных цитокинов, активность системы комплемента [1]. Изучение молекулярных механизмов взаимодействия поксвирусных белков с защитными системами человека открывает возможность их использования в терапии различных заболеваний. Показано, что некоторые поксвирусные белки инги-бируют отторжение алло- и ксенотранс-плантатов [2, 3] и воспалительные реакции [4, 5].
Адрес: ГНЦ ВБ "Вектор", Кольцово, Новосибирская область, 630559
телефон 8-383-2-366-205 e-mail: antonec@ngs.ru
Фактор некроза опухолей (TNF) и интерферон гамма (IFNy) принимают участие в реализации многих патологических реакций организма, в частности, эндотоксиче-ского шока [6]. Поиск субстанций, способных модулировать эффекты TNF и IFNy, представляет интерес для создания новых лекарственных препаратов для коррекции иммунопатологий человека. Кандидатами на роль таких препаратов могут быть TNF-и IFNy связывающие белки ортопоксвиру-сов [1].
Ранее нами получены рекомбинантные бакуловирусы, секретирующие рекомби-нантные TNF-связывающих белков (CrmB) вирусов натуральной оспы (VARV), оспы коров (CPXV) и оспы обезьян (MPXV) [7], а в настоящей работе — IFNy связывающих белков (IFNy BP) VARV и MPXV. Также разработан метод выделения этих вирусных белков из культуральной среды клеток насекомых, инфицированных рекомбинант-ными бакуловирусами [8].
CPXV-CrmB MPXV-CrmB VARV-CrmB + - + - + -
Рис. 1. Электрофоретическое фракционирование препаратов рекомбинантных VARV-CrmB, MPXV-CrmB, CPXV-CrmB (A); VARV-IFNgBP (Б, i), MPXV-IFNgBP (Б, ii) в редуцированных ( + ) и нередуцированных ( — ) условиях
Настоящая работа посвящена характериза-ции и оценке потенциальных терапевтических свойств вирусных TNF- и IFNy — связывающих белков.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Реагенты. В работе использовали электро-форетически гомогенные препараты VARV-CrmB, CPXV-CrmB, MPXV-CrmB, VARV- IFNy BP и MPXV- IFNy BP (рис. 1А, Б) и рекомбинантных TNF человека (hTNF), мыши (mTNF), кролика (rTNF) [9], мутеина hTNFR31Q [10]; человеческого лимфотоксина
(hLT) [11]; моноклональные антитела к TNF (MAb) (клон 195, "Boehringer Mannheim"); ре-комбинантный человеческий рецептор TNF второго типа (hrTNFRII) ("R&D system", США); рекомбинантный человеческий IFNy ("Sigma", США); ЛПС L2880 E. coli серотип 055:B5 ("Sigma", США).
Бактериальные штаммы и культуры клеток. Линии клеток Spodoptera frugiperda Sf21, мышиных фибробластов L929, фибробластов эмбриона легкого человека L68, а также вирус энцефаломиокардита мышей получены из коллекции культур микроорганизмов и культур клеток ГНЦ ВБ "Вектор". Клетки культивировали как описано ранее [9]. Штамм E. coli DH10Bac был предоставлен фирмой "Invitrogen" (США).
Определение биологической активности вирусных TNF-связывающих белков и IFNy-связывающих белков проводили по методам, описанным в работах [9] и [12], соответственно.
Электрофорез проводили по стандартной методике [13].
Животные. Самцов мышей линии BALB/с, возраст 3 — 4 недели, свободных от патогенной микрофлоры (SPF), получали из НПП "Питомник лабораторных животных" (г. Пу-щино Московской обл.). Опыты на животных проводили в соотвествии с Протоколом, утвержденным Биоэтическим комитетом ГНЦ ВБ "Вектор". Группы по 8—10 мышей формировали для визуального наблюдения и изучения выживаемости; и по 15 — 20 животных — для получения сывороток. Эксперименты повторяли от 2-х до 6-ти раз.
Индукция эндотоксического шока и изучение действия рекомбинаниного белка VARV-CrmB. Контрольным животным дважды, через 16 ч, вводили в/б по 100 мкл физиологического раствора (физ. р-р) (группа 1). Эндото-сический шок вызывали введением сенсибилизирующей (300 мкг/мышь) и, через 16 ч, разрешающей доз ЛПС (350 мкг/мышь) в 100 мкл физ. р-ра (группа 2). Белки VARV-CrmB, CPXV-CrmB и MPXV-CrmB вводили мышам в/б за 30 мин до введения разрешающей дозы ЛПС в дозе 2 мкг/мышь (группа 3, 4, 5, соответственно). По этой же схеме вводили в/б рекомбинантные белки VARV-CrmB, CPXV-CrmB и MPXV-CrmB контрольным мышам в дозе 2 мкг/мышь (группы 6, 7, 8, соответственно). Наблюдение за животными и учет гибели проводили в течение 72 ч. Гистологическое исследование проводили на мышах групп 1, 2, 3 и 6. Исследование проводили
через 1, 3, 6, 24, 30 и 48 ч после индукции шока. Изучали образцы головного мозга, миокарда, печени, легких, почек и брыжейки. Просмотр препаратов и микрофотосъемку проводили на световом микроскопе Jenaval ("Carl Zeiss", Германия).
Получение и анализ сывороток крови. У животных 1 и 2 групп индивидуально забирали кровь из ретроорбитального синуса через 1, 3, 6 и 24 ч после введения разрешающей дозы ЛПС, выдерживали при комнатной температуре до образования сгустка. Образцы сывороток получали путем центрифугирования крови при 1000 g в течение 10 мин., затем помещали в пробирки и хранили при —70 °С.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Электрофоретический анализ препаратов рекомбинантных ортопоксвирусных белков.
Рекомбинантные бакуловирусы, детерминирующие синтез секретируемых рекомбинантных VARV-IFNyBP и MPXV-IFNyBP были получены по схеме, используемой ранее для рекомбинантных CrmB [9]. Препараты рекомбинантных IFNyBP и CrmB, полученные с помощью аффинной хроматографии [8], фракционировали в редуцирующих и нереду-цирующих условиях (с и без ß-МЭ). Результаты анализов преведены на рис. 1 и они свидетельствуют, что в нередуцированных условиях электрофоретическая подвижность VARV-CrmB (молекулярная масса около 90 кДа), VARV-IFNyBP и MPXV-IFNyBP (молекулярная масса около 60 кДа) соответствует димерной форме белков, тогда как препараты MPXV-CrmB и CPXV-CrmB при используемой схеме выделяются в мономерной форме (рис. 1А, Б).
Изучение биологической активности вирусных CrmB и IFNyBP in vitro.
Для того чтобы продемонстрировать взаимодействие рекомбинантных вирусных CrmB с TNF, мы исследовали их способность нейтрализовать цитопатическое действие TNF на культуре клеток L929. На рис. 2 представлены зависимости выживаемости клеток L929 в присутствии в культуральной среде гетероло-гичных TNF (человека, мыши, кролика, муте-ин hTNFR31Q), а также человеческого LT и последовательных двукратных разведений (начиная с 1 мкг/мл) VARV-CrmB, CPXV-&mB, MPXV-CrmB. При проведении данных экспериментов использовали концентрации TNF, равные 1.5 нг/мл, которые, по данным предварительно проведенного определения их цитотоксичности соответствуют шести-
VARV-CrmB MPXV-CrmB CPXV-CrmB
И ЬЬТ ■ ■ ЬТТОТШС) □ тТОТ ПП гТОТ
Рис. 2. Ингибирование вирусными ТЫР-связывающими белками цитопатического действия ЬТЫР, ЬТЫЕ, ИЫРЯЭЩ, тТЫР и гТЫР на культуре клеток линии Ь929
кратной дозе, обеспечивающей 50% цитопатическое действие. Можно видеть, что VARV-CrmB практически с одинаковой эффективностью ингибирует цитопатическое действие человеческого, мышиного и кроличьего TNF. CPXV-CrmB эффективно ингибирует действие mTNF, но не hTNF. При использовании в качестве цитотоксичного агента мутеина hTNFR31Q, у которого аминокислотный остаток аргинина был заменен на глутамин, CPXV-CrmB ингибировал его активность столь же эффективно, как и mTNF (амино-
1 2 3 4 5 6 7 Концентрация TNF-связывающих белков, нг/мл
■ L929
■ hTNF + VARV-CrmB
■ hTNF + hrTNFRII
hTNF
hTNF + MAb
Рис. 3. Ингибирование УЛЯУ-СгтБ, МаВ и МТЫРЯЛ цитопатического действия ЬТЫР на культуре клеток линии Ь929. По оси абсцисс указаны концентрации ТЫР-связывающих белков (данные представлены в таблице 1); по оси ординат — процент жизнеспособных клеток. Концентрация ЬТЫР в культурной среде клеток Ь929 составляла 8 нг/мл
к а к ю о и о в и Ш
и п Я
100 90 80706050 40 30 20 ЮН 0
600
75 37,5 18,75 9,4 4,7 2,35 Концентрация INFgBPs, нг/мл
— L68 + IFNgBPs, + IFNg
— L68 + ВЭМКМ
— L68 + ВЭМКМ + IFNg
— L68 + ВЭМКМ + IFNg + VARV-IFNgBP
— L68 + ВЭМКМ + IFNg + MPXV-IFNgBP
Рис. 4. Ингибирование рекомбинантными вирус
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.