МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 6, с. 966-972
== ГЕНОМИКА. ТРАНСКРИПТОМИКА. ПРОТЕОМИКА ^
УДК 577.2:616.006
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ АНОМАЛЬНОГО МЕТИЛИРОВАНИЯ CpG-ОСТРОВКОВ, РАСПОЛОЖЕННЫХ В ПРОМОТОРНЫХ ОБЛАСТЯХ ГЕНОВ p16/CDKN2A И pl4/ARF, ПРИ НЕМЕЛКОКЛЕТОЧНОМ РАКЕ ЛЕГКОГО И ОСТРОМ ЛИМФОБЛАСТНОМ ЛЕЙКОЗЕ
© 2004 г. В. В. Землякова1, В. В. Стрельников2, И. Б. Зборовская3, О. В. Балукова3, О. А. Майорова4, Е. В. Васильев1, Д. В. Залетаев1,2*, М. В. Немцова1
1Медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук, Москва, 115478 2Научно-исследовательский институт молекулярной медицины при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва, 119992 3Научно-исследовательский институт канцерогенеза, Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина Российской академии медицинских наук, Москва, 115478 4Государственное учреждение Научно-исследовательский институт детской гематологии Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва, 117531 Поступила в редакцию 27.10.2003 г.
С использованием мультилокусной метилчувствительной ПЦР и метилспецифичной ПЦР изучено аномальное метилирование СрО-островков, расположенных в промоторных областях и в районе первых экзонов генов p16/CDKN2A и p14/ARF, в 54 образцах немелкоклеточного рака легких и в 61 образце острого В-клеточного лимфобластного лейкоза. Обнаружены различия в метилировании СрО-островков как в изученных образцах, так и в неоплазиях разного типа. Выявлен высокий уровень метилирования СрО-островка, расположенного в области первого экзона гена p16/CDKN2A, при немелкоклеточном раке легкого (68%) и при В-клеточном лимфобластном лейкозе (55%) и отсутствие метилирования СрО-островка в области первого экзона гена p14/ARF в этих злокачественных новообразованиях. Проанализировано метилирование СрО-богатых фрагментов, расположенных в промоторных областях генов p16/CDKN2A и p14/ARF. Установлено, что участки, обогащенные СрО-динуклеотидами и входящие в 5'-промоторную область одного гена, могут метилироваться с различной частотой. Сравнили чувствительность метилспецифичной и метилчувствительной ПЦР, используемых при изучении метилирования.
Ключевые слова: генp16/CDKN2A, генp14/ARF, СрО-островок, промоторный район, метилчувстви-тельная ПЦР, метилспецифичная ПЦР, метилспецифическое секвенирование, немелкоклеточный рак легкого, острый В-клеточный лимфобластный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз.
ABNORMAL METHYLATION OF p16/CDKN2A AND p14/ARF ОЕШБ ОрО ISLANDS IN NON-SMALL CELL ШЧО CANCER AND IN ACUTE LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA, by V. V. Zemlyakova1, V. V. Strelnikov2,I. B. Zborovskaya3, O. V. Balukova3, O. A. Mayorova4, E. V. Vasil'ev1, D. V. Zaletayev1,2*, M. V. Nemtsova1 ^Research Center for Medical ОепеИсз, Russian Academy of Mecical Sciences, Moscow, 115478 Russia, E-mail: zalnem@online.ru; 2Institute of Molecular Medicine, Sechenov Moscow Medical Academy, Russian Federation Ministry of Health, Moscow, 119992 Russia; 3Institute of Carcinogenesis, Blokhin Cancer Research Center, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow, 115478 Russia; 4Child Hematology Research Institute, Russian Ministry of Health, Moscow, 117531 Russia). Multiplex methylation-sensitive PCR and methylation-specific PCR were employed in studying the methylation of СрО islands in the p16/CDKN2A and p14/ARF promoter and the first exon regions in non-small cell lung cancer (54 samples) and acute B-cell lymphoblastic leukemia (61 samples). Differences in methylation were detected between types of neoplasia as well as between СрО islands studied within the same types of tumors. High level of the p16/CDKN2A first exon CpC island methylation was revealed in non-small cell lung cancer (68%) and in acute B-cell lymphoblastic leukemia (55%) and the СрО island of p14/ARF first exon was nonmethylated in these types of tumors. The methylation of СрО-rich fragments of genes p16/CDKN2A and p14/ARF promoters was analysed. As was found out, СрО islands located in 5' areas of one and the same gene can differ in methylation frequencies. The comparison of sensitivity between methylation-specific PCR and methylation-sensitive PCR used in the methylations studies was carried out.
* Эл. почта: zalnem@online.ru
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ АНОМАЛЬНОГО МЕТИЛИРОВАНИЯ CpG-OCTPOBKOB
967
Один из основных механизмов инактивации генов-супрессоров опухолевого роста - аномальное метилирование цитозинов, расположенных в CpG-островках, ассоциированных с активно работающими промоторными районами генов. Гиперметилирование CpG-островков известных генов-супрессоров опухолевого роста и других генов, вовлеченных в канцерогенез, приводящее к их инактивации, обнаружено в различных злокачественных опухолях человека [1].
Локус INK4a/ARF, расположенный на коротком плече хромосомы 9р21, часто повреждается при различных новообразованиях человека. Структурные и функциональные аномалии локу-са INK4a/ARF наблюдаются при меланоме, раке молочной железы, пищевода, желчных путей, Ти В-клеточных острых лимфобластных лейкозах (В-ОЛЛ), глиобластомах [2-5]. В этом районе расположены гены, кодирующие два ядерных белка -p16/CDKN2A и р14/АКР, выполняющих в клетке супрессорные функции [6].
Гены pió и p!4/ARF имеют общие второй и третий экзоны, но разные промоторные области и разные первые экзоны [7]. Схема расположения генов представлена на рис. 1.
Продукты этих генов - белки р16 и ARF, играют важную роль в регуляции клеточного цикла. Ген pió принимает участие в регуляторном пути Cdk-Rb-E2F, а ген pi4 - в регуляторном пути р53-MDM2.
Ядерный белок р16 ингибирует циклинзависи-мые протеинкиназы, фосфорилирующие RB1, что приводит к инактивации RB1, последующему высвобождению фактора транскрипции E2F из комплекса RB1-E2F и переходу клеток из G1 в S-фазу клеточного цикла [8]. Делеции гена pió часто регистрируют в опухолях самого разного происхождения, но основным механизмом его инактивации является аномальное метилирование промоторной области.
Продукт гена pi4/ARF - ядерный белок, который повышает содержание в клетке активного р53 - "хранителя генома". Белок р^/ARF связывает свободный MDM2, который взаимодействует с р53 и приводит к его деградации. Таким образом, инактивация ARF в результате структурных нарушений или аномального метилирования промоторной области повреждает тонкий механизм поддержания нормального уровня р53 [9].
В генах pió и pi4/ARF достаточно протяженные CpG-островки располагаются как в промоторной области, так и в первом экзоне. По всей длине этих районов распределены участки связывания факторов транскрипции, что делает их значимыми для регуляции экспрессии гена [7, 20]. Метилирование участков первого экзона генов pió и pi4/ARF проанализировано в [1, 3, 10, 11]. В настоящей работе представлен анализ метилирования CG-динуклеотидов, расположенных в разных частях CpG-островков промоторной области и первого экзона генов pió и pi4 в неопла-
pi4/ARF
pió
Рис. 1. Схема расположения генов pió и pi4/ARF в ло-
кусе 9р21.
зиях различного типа. Аномальное метилирование этих генов в образцах немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) (54 образца) и В-ОЛЛ (61 образец) изучали с использованием метил-чувствительной ПЦР (МЧ-ПЦР) и метилспе-цифичной ПЦР (МС-ПЦР).
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Образцы опухолевой ткани получены от 54 больных НМРЛ, прооперированных в клинике РОНЦ РАМН за период с 1993 по 1998 г., причем ни один из больных не подвергался дооперационной химио- или радиотерапии. Сразу после удаления органа образцы тканей замораживали и хранили в жидком азоте. Все опухоли классифицированы по TNM согласно требованиям Международного противоракового союза (UICC, версия 1989 г.). Гистологическую идентификацию тканей проводили в отделе патоморфологии опухолей НИИ клинической онкологии РОНЦ РАМН [12].
Образцы периферической крови 61 больного острым В-ОЛЛ получены в НИИ детской гематологии МЗ РФ. Диагноз был поставлен и подтвержден с использованием стандартного набора методов: общего анализа крови с подсчетом лейкоцитарной формулы, микроскопического и цитохимического исследования мазков костного мозга, иммунофенотипирования бластных клеток, цитогенетического обследования.
Геномную ДНК из опухолевой ткани и из лимфоцитов крови выделяли с использованием фенол-хлороформной экстракции [13]. Метилирование CpG-островков, расположенных в 5'-облас-тях генов pi4 и pió, определяли с использованием МЧ-ПЦР (принцип метода и условия приведены в [14]). С целью исключения гомозиготной делеции МЧ-ПЦР проводили на парных образцах негид-ролизованной и гидролизованной ДНК. Метилирование первого экзона гена pió изучали также при помощи МС-ПЦР. Метод МС-ПЦР основан на предварительной обработке образцов ДНК бисульфитом натрия, что приводит к дезаминиро-ванию цитозина с образованием урацила, метилированные остатки цитозина при этом остаются неизменными. Специально подобранные прайме-ры избирательно отжигаются на нуклеотидной последовательности, содержащей или не содержащей метилированные остатки цитозина в CpG-островках [15]. Модифицированную ДНК очищали от бисульфита натрия с помощью колонок для
GC-пары, %
80 60 40 20
0 -1500 -1000 -500 0
CPG I I II ¡lllllIIIIUlillllll I I I lllllll'll f III Ml IHilllin II I I I IllllUllfl lllllllili III IMIMIIIIMIIIMII II Г1
IR
IR
p14ARFpr p14ARFex1
СрО-островок
Рис. 2. Промоторная область гена р14/ЛЯР. Внизу показано положение праймеров для МЧ-ПЦР.
очистки ДНК Wizard DNA Clean-up system ("Promega", США).
Нуклеотидные последовательности праймеров для промоторных областей генов р14 и р16 подбирали при помощи программы Oligo 4.0: p16pr F - gaacgcactcaaacacgc; р16рг R - agccagc-ccctcctctttcttc; р14рг F - agtcccgaatcctctggcaca; р14рг R - ggcagaaaggaggggtgagtc. Праймеры и условия ПЦР для первых экзонов приведены в [3]. Продукты ПЦР разделяли в 8%-ном полиакриламид-ном геле и окрашивали нитратом серебра [16].
Реакцию секвенирования проводили на приборе ABI Prism 310 с использованием Genetic
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.