БИОХИМИЯ, 2008, том 73, вып. 8, с. 1124 - 1130
УДК 577.213
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ АНТИРЕСТРИКЦИОННОЙ АКТИВНОСТИ БЕЛКОВ ArdA (ColIb-P9) И Ocr (T7)
© 2008 г. Г.Б. Завильгельский*, В.Ю. Котова, С.М. Расторгуев
Государственный научно исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ФГУП«ГосНИИгенетика»), 117545 Москва, 1-й Дорожный пр., 1; факс: (495)315-0501, электронная почта: zavilgel@genetika.ru
Поступила в редакцию 30.01.08
Антирестрикционные белки ArdA и Ocr специфически ингибируют ферменты рестрикции-модификации I типа. Проведено клонирование генов ardA (конъюгативная плазмида ColIb-P9) и 0.3 (ocr) (бактериофаг Т7) в мультикопийном векторе pUC18 под промотором Plac. Показано, что белки ArdA (ColIb-P9) и Ocr (T7) эффективно ингибируют как рестрикционную (эндонуклеазную), так и модификационную (метилазную) активности фермента EcoKI. Проведено клонирование генов ardA, 0.3 (ocr) и luxCDABE Photorhabdus lumi-nescens в векторах серии pZ со строго регулируемым промотором PltetO-1 под контролем репрессора TetR. Показано, что в зависимости от концентрации индуктора ангидротетрациклина в среде интенсивность биолюминесценции клеток Escherichia coli K12 MG1655Z1 tetR+ (pZE21-luxCDABE) и, соответственно, внутриклеточная концентрация люциферазы варьирует в 5000 раз. Проведены измерения эффективности антирест-рикционной активности белков ArdA и Ocr в клетках MG1655 Z1, содержащих гибридные плазмиды серии pZ с соответствующими генами, и при таких же концентрациях индуктора экспрессии генов. Согласно полученной биолюминесцентным методом калибровочной кривой определены относительные значения внутриклеточных концентраций белков ArdA и Ocr, а также Kd для комплексообразования этих белков с ферментом EcoKI. Показано, что Kd (ArdA) примерно в 1700 раз превышает Kd(Ocr) и составляет 1,7 • 10-7М.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: антирестрикционные белки, ферменты рестрикции-модификации I типа, ArdA, Ocr, luxCDABE, биолюминесценция, люцифераза.
Гены ard (alleviation of restriction of DNA) ответственны за синтез небольших по размеру (140—180 а.о.) кислых белков (суммарный заряд молекулы равен —10: —30), являющихся специфическими ингибиторами рестрикционных эн-донуклеаз I типа [1—3]. Расположены гены ard в лидерной области конъюгативных плазмид и одними из первых входят в клетку-реципиент при конъюгативном переносе ДНК [4, 5]. Гены ard играют важную роль при переносе ДНК между бактериальными клетками разных видов и родов, помогая плазмидам преодолевать рест-рикционные барьеры. Геном бактериофага Т7 содержит ген 0.3 (ocr), кодирующий антирест-рикционный белок Ocr, однако он не гомологичен белкам семейства Ard и значительно короче (116 а.о.), но, как и белки Ard, несет значительный отрицательный заряд [6].
Антирестрикционные белки относятся к семейству ДНК-мимикрирующих белков (protein mimicry of DNA), пространственная структура которых имитирует B-форму биспиральной ДНК [7, 8]. Мимикрия белка под форму биспи-ральной ДНК позволяет антирестрикционно-
* Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
му белку конкурировать с ДНК за место связывания с ферментом рестрикции-модификации и тем самым ингибировать процессы деградации (рестрикции) и метилирования (модификации) ДНК. С позиции классического ферментативного катализа механизм антирестрикции является примером конкурентного ингибирова-ния, осуществляемого молекулой-ингибитором за счет структурного подобия с природным субстратом.
По функциональной активности белки АгёА и Осг практически не различаются, так как специфически ингибируют лишь ферменты АТР-зависимой системы рестрикции-модификации I типа. Однако в связи со значительным различием в жизненном цикле конъюгативных плазмид (симбиоз с бактериальной клеткой) и бактериофагов (заражение и лизис бактерий) представляет интерес сравнение эффективности ингибиру-ющего действия этих белков.
Для выполнения поставленной задачи были проведены клонирование генов агйА и О.З(осг) под строго регулируемым промотором и измерение антирестрикционной активности в зависимости от концентрации белка-ингибитора в бактериальной клетке.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Бактериальные штаммы, бактериофаги и плаз-
миды. В работе использовали штамм Escherichia coli K12 MG1655 Z1, который содержит в составе хромосомы ген, кодирующий TetR, белок-репрессор промотора PtetA. Данный штамм был получен трансдукцией с помощью фага P1; в качестве донора использовали клетки E. coli DH5aZ1 tetR, в геноме этого штамма ген tetR тесно (90% котрансдукции) сцеплен с геном, определяющем резистентность бактерии к спек-тиномицину.
В работе использовали также следующие штаммы E coli K-12: JM109 recA1 endA1 gyrA96 thi supE44 relA1 hsdR17 Alac-proAB) [F'traD36 proAB lacIqZ A M15]; TG-1 thi relA supE44 hsdR17 hsdM Alac-proAB) [FtaD36 proAB lacIqZ AM15]; AB1157 F-thr-1, leu-6, proA2, his-4, thi-1, argE3, lacY1, galK2, ara14, xyl-5, mtl-1, tsx-33, rpsL31, supE44, r+m+; а также E. coli Cs rom„ (прототроф). Все штаммы получены из коллекции «ГосНИИгенетика».
Бактериофаги Р1 и Т7 получены из коллекции «ГосНИИгенетика». Бактериофаг Xvir получен от Р. Деворе, Франция. В работе использовали немодифицированные фаги X.0 и модифицированные фаги X.K, выращенные на E. coli Cs (или TG-1) и E. coli K12 AB1157 соответственно.
В качестве векторов, содержащих строго регулируемый промотор, использовали векторы серии pZ с репликонами ColE1 (pZE21 Knr) и pSC101 (pZS33 Cmr): копийность векторов составляет 60-70 и 8-10 копий на клетку соответственно [9]. В качестве строго регулируемой промоторной-операторной области в данные векторы встроен фрагмент ДНК, содержащий
PltetO-1.
Промотор PltetO-i состоит из промоторной части Pl из генома фага X, и из операторной части tetO2 из регуляторной области оперона тетрациклин-резистентности транспозона Tn10 [9]. Векторы pZE21 Knr и pZS33 Cmr содержат также последовательность Шайна-Дальгарно (RBS) и полилинкер, обеспечивающий встраивание фрагмента ДНК с исследуемым геном.
В работе использовали также векторы серий pUC. Мультикопийные плазмиды выделяли щелочным методом согласно [10].
Cреды, ферменты, реактивы. Для выращивания культур и в опытах с клонированием использовали L-бульон и L-агар. Концентрации антибиотиков в питательных средах составляли: ампициллин 100 мкг/мл, канамицин 40 мкг/мл, хлорамфеникол 15 мкг/мл. Реакции расщепления и лигирования проводили с использованием ферментов фирмы «Fermentas» (Литва). Трансформацию клеток E. coli проводили каль-
циевым методом согласно [10]. В качестве индуктора экспрессии генов в штамме E. coli MG1655Z1 с гибридными плазмидами серии pZ использовали ангидротетрациклин («Sigma»).
Конструирование плазмид. В качестве источника гена ardA использовали плазмиду pVK6 c встроенным в нее геном ardA ColIb-P9 [11]. В качестве источника гена 0.3 (ocr) использовали ДНК бактериофага Т7. Эндонуклеотическое расщепление, лигирование фрагментов ДНК, электрофорез в агарозном геле, выделение фрагментов ДНК из агарозного геля проводили согласно [10]. Для клонирования гена ardA ColIb-P9 использовали в качестве праймеров следующие олигонуклеотиды с последующим накоплением продуктов с помощью ПЦР:
BamHI
ardA-Ndir 5'-CTGGGATCCGGGAATGTCTGTT-GTTGC-3';
PstI
ardA-Nrev 5'-CATTCTGCAGCGGGGGAGTAA-ATCACCG-3'.
Для клонирования гена 0.3 (ocr) T7 использовали в качестве праймеров следующие олиго-нуклеотиды oer-Ndir и ocr-Nrev:
BamHI
oer-Ndir 5'-TTATGGGATCCACTAATAACTGCAC-3';
HindIII
ocr-Nrev 5'-CCGTATTGAAGCTTGGTAGTAGAC-3'.
На втором этапе гены ardA и 0.3 (ocr) переклонировали в векторы pZE21 и pZS33 под контроль строго регулируемого промотора PitetO-i. Встраивание фрагментов ДНК в векторы проводили по сайтам KpnI и HindIII.
В качестве источника lux-генов использовали плазмиду pXen7, содержавшую гены luxCDABE Photorhabdus luminescens ZM1 [12]. Встраивание фрагмента ДНК с этими генами в векторы pZE21 и pZS33 проводили по сайтам KpnI—HindIII.
Измерение антирестрикционной и антимоди-фикационной активностей белков ArdA и Ocr. Для измерения антирестрикционной и антимоди-фикационной активностей белков ArdA и Oer использовали штаммы E. coli K-12 AB1157 и JM109 (с гибридными плазмидами на основе вектора pUC18) и MG1655Z1 (с гибридными плазмидами на основе векторов серии pZ). Клетки штаммов AB1157 и MG1655Z1 содержат активную систему рестрикции—модификации I типа EcoKI (R2M2S), клетки штамма JM109 содержат метилазную форму M2S.
Методика измерения антирестрикционной и антимодификационнойи активностей у белков семейства Агё описана в [4, 11].
Измерение интенсивности биолюминесценции. Измерения интенсивности биолюминесценции суспензии клеток проводили на люминометре, состоящем из фотоумножителя ФЭУ-85 и микровольтметра В2-15. Измерение биолюминесценции проводили в специальных кюветах при комнатной температуре при объеме суспензии 200 мкл.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Конструирование гибридных плазмид. На первом этапе клонирование генов ardA ColIb-P9 и 0.3 (ocr) T7 проведено в векторе pUC18 по сайтам BamHl—Pstl. Фрагмент ДНК размером около 500 п.н., содержащий ген ardA ColIb-P9, был получен с помощью ПЦР с использованием праймеров ardA-Ndir и ardA-Nrev; в качестве матрицы использовали плазмиду pVK6. Фрагмент ДНК размером около 400 п.н., содержащий ген 0.3 (ocr), также был получен с помощью ПЦР с использование праймеров ocr-Ndir и ocr-Nrev; в качестве матрицы использовали ДНК фага Т7. В результате были сконструированы плазмиды pSR5 и pSR8, содержащие под промотором Plac гены ardA ColIb-P9 и 0.3 (ocr) T7 соответственно.
На втором этапе гены ardA и 0.3 (ocr) переклонировали в векторы pZE21 и pZS33 под контроль строго регулируемого промотора PltetO-1. Встраивание фрагментов ДНК в векторы проводили по сайтам KpnI—Hindlll.
Конструированные таким образом гибридные плазмиды pZE21-ardA, pZS33-ardA, pZE21-ocr, pZS33-ocr вводили путем трансформации в клетки штамма E. coli MG1655Z1. В качестве индуктора транскрипции промотора PltetO-i использовали производное тетрациклина — ангидро-тетрацикдин, который, как и тетрациклин, взаимодействуя с белком-репрес
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.