ОНТОГЕНЕЗ, 2007, том 38, № 2, с. 126-135
^ ЭМБРИОГЕНЕЗ
И КАНЦЕРОГЕНЕЗ
УДК 611-013;57.086.835;577.218
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ФАКТОРОВ СЕМЕЙСТВА TGFß И ИХ РЕЦЕПТОРОВ В ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ И ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ТЕРАТОКАРЦИНОМНЫХ КЛЕТКАХ МЫШИ1
© 2007 г. Н. Ю. Красникова, О. Ф. Гордеева
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 119334 Москва, ул. Вавилова, д. 26 E-mail: olgagordeeva@yandex.ru Поступила в редакцию 07.11.06 г.
Специфические факторы, определяющие выбор клеточной судьбы в раннем эмбриогенезе, модулируются при взаимодействии сигнальных путей, формируя уникальную регуляторную сеть внутри клеток, необходимую для дифференцировки различных клеточных популяций. В работе проведено сравнительное исследование экспрессии генов факторов роста семейства TGFß и их рецепторов на начальных стадиях дифференцировки эмбриональных стволовых клеток, при формировании сфероидов эмбриональных тератокарциномных клеток и росте опухолевых клеток in vivo в иммуноде-фицитных мышах. Показано, что паттерны экспрессии генов факторов Activin, Nodal, Lefty1, Lefty2, BMP, TGFß1 и их рецепторов ActRI, ActRIl , BMPR1, TGFß1R1, Tdgf идентичны. Экспрессии белков а-фетопротеина и транскрипционного фактора Gata4, специфических для первичной энтодермы, выявлены в клетках эмбриональной тератокарциномы. В недифференцированных эмбриональных стволовых клетках экспрессия Gata4 обнаружена на уровне мРНК, а экспрессия на уровне белков появляется только в клетках первичной энтодермы в эмбриодных телах. Полученные результаты свидетельствуют, что, несмотря на существование у эмбриональных стволовых клеток и клеток эмбриональной тератокарциномы сходных сигнальных систем, присутствие различных специфических внутриклеточных факторов в целом формирует принципиально различные регуляторные сети в этих клетках, которые определяют программу их дифференцировки.
Ключевые слова: эмбриональные стволовые клетки, тератокарцинома, факторы семейства TGFß, дифференцировка, плюрипотентность, сигнальные пути.
Программа эмбрионального развития живых организмов, которая обеспечивается дифференциальной активностью различных генов, создает строго определенные пространственно-временные паттерны экспрессии в развивающихся областях зародыша и координирует их взаимодействия. Известно, что в гистогенезе тканей и при физиологической регенерации обновляющихся тканей во взрослом организме имеются принципиально сходные механизмы регуляции. Нарушения сигнальных и регуляторных каскадов, которые обеспечивают и контролируют дифференци-ровку стволовых клеток в соответствующие типы клеток, приводят к различным патологическим процессам, включая канцерогенез. Показано, что при многих формах рака в опухолевых клетках обнаруживается активность некоторых белков или их изоформ, характерных для эмбриональных тканей (например, а-фетопротеин,
1 Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проекты < 05-04-49185а, 06-04-08279-офи) и Программой Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология".
AFP), изменяется структурная организация хроматина, т.е. трансформированные клетки приобретают свойства эмбриональных клеток этой ткани (Abelev, 1971; Hair et al., 2002). Сравнительный анализ механизмов гистогенеза эмбриональных тканей и процессов онкогенной трансформации является перспективным подходом в изучении фундаментальных закономерностей нормального и патологического развития.
Плюрипотентные клетки эмбриона, являясь источником всех тканей и органов будущего организма, в процессе раннего развития дифференцируются в предшественников трех зародышевых листков и линию половых клеток. Этот тип клеток существует небольшой период у всех млекопитающих от стадии поздней морулы до стадии раннего яйцевого цилиндра сразу после имплан-тиции (ст. E3-E4.5). Линии эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), полученные из плюрипо-тентных клеток эмбрионов, преимущественно стадии бластоцисты (E3.5), сохраняют плюрипо-тентный статус в течение длительного периода культивирования in vitro в соответствующих
условиях (Evans, Kaufman, 1981; Martin, 1981; Rossant, 2001). Их малигнизированные аналоги - линии клеток эмбриональной тератокарциномы -были получены из спонтанных опухолей семенников и яичников у мышей и человека, однако биологические свойства этих линий имеют значительное сходство (см. обзор: Andrews, 2002). Существующие литературные данные указывают на то, что появление тератокарциномных клеток в гонадах является результатом нарушения механизмов контроля специализации первичных половых клеток из плюрипотентных клеток (Andrews, 2002; Kimura et al., 2003). Хромосомные и генные мутации, которые несут тератокарцином-ные клетки, влияют на специфичность их диффе-ренцировки в определенные типы клеток или полностью ограничивают все дифференцировки, что происходит в случае нуллипотентных клеточных линий (Blelloch et al., 2004)). Специфические сигналы, которые обусловливают выбор клеточной судьбы в раннем эмбриогенезе, модулируются через взаимодействие нескольких сигнальных путей, формируя уникальную регуляторную сеть внутри клетки, необходимую для дифференцировки определенного типа клеток. Известно, что факторы семейства TGF^ (Activin, Nodal, Lefty, BMP, TGFp) играют важную роль в специализации предшественников экто-, энто- и мезодермы, а также линии половых клеток (Saijoh et al., 1999; Tremblay et al., 2001; Panchision et al., 2001; Vincent et al., 2003). Эти факторы осуществляют регуляцию процессов морфогенеза, формирование осей полярности и общего плана строения раннего зародыша (Zernicka-Goetz, 2002). Факторы семейства TGFP контролируют дифференцировку различных типов клеток в обновляющихся тканях взрослого организма, и их повышенная активность часто обнаруживается в различных раковых опухолях (см. обзор: Reya et al., 2001).
В нашей работе изучение активности сигнальных путей, которые регулируются факторами семейства TGFp, в ЭСК и эмбриональных тератокарциномных клетках было сфокусировано на выявлении экспрессии лигандов этого семейства и их рецепторов, а также специфических внутриклеточных переносчиков сигналов для установления характерных профилей экспрессии для недифференцированных и дифференцирующихся клеточных популяций. Мы также проводили сравнительный анализ профилей генной экспрессии в клетках эмбриональной тератокарциномы, растущей in vitro и in vivo, после трансплантации их иммунодефицитным мышам.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Культивирование клеток in vitro. В работе были использованы ЭСК мыши линии R1, любезно предоставленные доктором А. Макларен
(А. McLaren, WTCR Institute of Cancer and Developmental Biology, Cambridge, UK), и линия F9 эмбpи-ональной тepaтoкapцинoмы мыши (Банк клеточных культуp ИНЦ РАН, C.-Пeтepбуpг). ЭCK мыши культивиpoвaли в сpeдe DMEM, сoдepжaщeй 1 yM L-глутамин, 0.1 мM заменимые аминокислоты, 0.1 hM ß-мepкaптoэтaнoл и 15% телячьей фе-тальной сывopoтки ("HyClone", C^MA). Kультиви-poвaниe тepaтoкapцинoмныx клеток линии F9 пpoвoдили по стaндapтнoму методу в сpeдe DMEM с добавлением L-глутамина и 10% телячьей фетальной ^ieopo^^. Heдиффepeнциpo-ванные Э^^ R1 пoддepживaли на фидepe из ^p-вичных эмбpиoнaльныx фибpoблaстoв мыши, инaктивиpoвaнныx митомицином C (10 мкг/мл) в течение 3 ч ("Sigma", CШA). Для получения стан-дapтныx эмбpиoидныx тел использовали метод "висячей капли": капли суспензии ЭCK и клеток линии F9 (кoнцeнтpaция 300 тыс/мл) помещали на ^ышку чашки для фopмиpoвaния эмбpиoидныx тел на 4-5 сут культивиpoвaния. Одну часть сфop-миpoвaныx эмбpиoидныx тел сoбиpaли из капель и использовали для мoлeкуляpнoгo анализа, а дpугую часть пepeнoсили в новые чашки, помытые 0.1%-ным желатином ("Sigma", CШA), для получения диффepeнциpующиxся эмбpиoидныx тел. Исследование экспpeссии специфических генов пpoвoдили в нeдиффepeнциpoвaнныx клетках, сфopмиpoвaнныx эмбpиoидныx телах и диф-фepeнциpующиxся эмбpиoидныx телах (4-6 сут после пpикpeплeния к адгезивному субстрату).
Получение тератокарцином in vivo. Для получения экспepимeнтaльныx тepaтoкapцинoм в качестве peципиeнтoв использовали иммунодефи-цитных мышей линии Nude из питомника лaбopa-TOprnix животных НПП "Пущино" ФИБХ РАН (стоковая линия получена из питомника Charles Rivers, CШA). Cуспeнзию клеток тepaтoкapцинo-мы линии F9 вводили каждому животному подкожно в область шеи (500 тыс. клеток/мышь). Че-peз 4 нед после инъекции клеток животных забивали, извлекали paзвившиeся тepaтoкapцинoмы, paзмep ^TOphix достигал около 2 см в диaмeтpe. Опухолевый мaтepиaл использовали для дальнейших исследований.
Maтepиaл тepaтoкapцинoм фиксиpoвaли в 10%-ном фopмaлинe, обезвоживали по CTa^ap^ ной методике и заливали в пapaфин для пpигoтoв-ления сpeзoв. Гистологические пpeпapaты о^аши-вали гематоксилином и эозином, а затем исследовали с помощью системы анализа ми^ож^иче^^ изoбpaжeний Leica DMRXA2, TepManra.
Иммуногистохимический анализ. Выявление экспpeссии специфических белков пpoвoдили с помощью иммунoфлуopeсцeнтнoгo анализа. KreTOH фиксиpoвaли 3%-ным paствopoм rapa-фopмaльдeгидa в фосфатно-солевом буфepe ("Sigma", CШA). Для ингибиpoвaния неспецифи-
ческого связывания и пермеабилизации клеточные препараты инкубировали в растворе 0.3%-ного Тритона X-100 и 4%-ного сывороточного альбумина быка (фракция V, "Sigma", США) в фосфатном буфере. Для выявления экспрессии AFP и транскрипционных факторов Oct4 и Gata4 использовали антитела к этим белкам в разведениях, рекомендованных производителем ("R & D Systems", "Santa Cruz Biotechnology", США). Для флуоресцентной детекции использовали соответствующие вторичные антитела в разведении 1 : 900 ("Molecular Probes", США). Препараты докрашивали флуоресцентным красителем DAPI для визуализации клеточных ядер и заключали в среду Mow-iol ("Sigma", США). ^нтрольные препараты обрабатывали так же, как и опытные образцы, исключая добавление первичных антител. Pегистрацию специфического окрашивания и фотографирование препаратов проводили с использованием системы анализа изображений Leika DMRXA2 (Германия) и Olympus CK40 (Япония).
Анализ генной экспрессии. Для анализа экспрессии изучаемых генов выделя
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.