научная статья по теме СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ЗАЩИТНЫХ СИСТЕМ У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ГАЛОФИТНОЙ И ГЛИКОФИТНОЙ ФЛОРЫ В УСЛОВИЯХ ПРОГРЕССИРУЮЩЕГО ЗАСОЛЕНИЯ Биология

Текст научной статьи на тему «СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ЗАЩИТНЫХ СИСТЕМ У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ГАЛОФИТНОЙ И ГЛИКОФИТНОЙ ФЛОРЫ В УСЛОВИЯХ ПРОГРЕССИРУЮЩЕГО ЗАСОЛЕНИЯ»

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 6, с. 902-912

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УДК 581.1

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ЗАЩИТНЫХ СИСТЕМ У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ГАЛОФИТНОЙ И ГЛИКОФИТНОЙ ФЛОРЫ В УСЛОВИЯХ ПРОГРЕССИРУЮЩЕГО ЗАСОЛЕНИЯ

© 2007 г. Н. Л. Радшкина*, А. В. Карташов*'**, Ю. В. Иванов*, Н. И. Шевякова*, Вл. В. Кузнецов****

*Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва **Пензенский государственный педагогический университет им. В.Г. Белинского, Пенза ***Российский университет дружбы народов, Москва Поступила в редакцию 22.03.2007 г.

Растения Plantago major L. и Thellungiella halophila Mey. в возрасте шести недель подвергали прогрессирующему засолению, при котором концентрация NaCl в питательной среде увеличивалась на 100 мМ ежедневно до достижения конечной концентрации соли 400 мМ. Изучали динамику стресс-зависимой аккумуляции ионов (Na+ и Cl), пролина и свободных полиаминов, а также активности ан-тиоксидантных ферментов - супероксиддисмутазы (СОД), свободной, ион-связанной и ковалентно-связанной форм гваякол-зависимой пероксидазы. Исследовали уровни экспрессии генов, кодирующих ферменты метаболизма пролина и биосинтеза полиаминов. Показано, что в основе высокой со-леустойчивости галофита T. halophila лежит его способность к аккумуляции ионов и стресс-зависимому накоплению пролина. Важную роль в поддержании клеточного гомеостаза у этого растения в условиях солевого стресса играет высокий конститутивный уровень активности трех исследованных форм пероксидаз, а также пролина, обладающего полифункциональным протекторным эффектом. Напротив, растения P. major, характеризующиеся более низкой устойчивостью к избыточному засолению, не обнаруживали высокого конститутивного уровня пролина или активности гваякол-зависимых пероксидаз, а также не проявляли способности к стресс-индуцируемому накоплению совместимых осмолитов или выраженной солеаккумулирующей способности. Вместе с тем, у этого гликофита обнаружили достаточно высокий конститутивный уровень спермидина и СОД, что обеспечивало снижение повреждающего действия активных форм кислорода при солевом шоке. Установлено, что у обоих видов растений при засолении изменяется внутриклеточное содержание полиаминов, не зависящее от интенсивности транскрипции генов, кодирующих ферменты их биосинтеза. Полученные данные подтверждают гипотезу, согласно которой как галофитные, так и гликофитные виды растений имеют некоторые общие механизмы устойчивости к засолению, регуляция функционирования которых существенно различается.

Ключевые слова: Thellungiella halophila - Plantago major - засоление - пролин - полиамины - су-пероксиддисмутаза - гваяколовые пероксидазы.

ВВЕДЕНИЕ

Изучение механизмов адаптации растений к воздействиям стрессоров является одним из приоритетных направлений современных биологических исследований. "Стратегия" адаптации растений к экстремальным факторам среды зависит от генотипа, определяющего морфологические, биохимические и физиологические механизмы, обеспечивающие рост и развитие растений в ранее неблагоприятных условиях [1]. Так, высокие концен-

Сокращения: АФК - активные формы кислорода, ПЦР -полимеразная цепная реакция, ОТ-ПЦР - обратная тран-скрипция-ПЦР, СОД - супероксиддисмутаза. Адрес для корреспонденции: Радюкина Наталия Львовна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений. Электронная почта: natrad@yandex.ru

трации солей вызывают нарушение ионного, осмотического и окислительного статуса организма. Поддержание клеточного гомеостаза в этих условиях достигается за счет аккумуляции и ком-партментации ионов, синтеза совместимых осмолитов, накопления свободных полиаминов, изменения активности антиоксидантных ферментов, а также новообразования стресс-белков, обладающих функциями молекулярных шаперонов [2-4].

В последнее время механизмы устойчивости к солевому стрессу интенсивно изучаются на новом модельном растении - Тке11ип^^е11а ИаЬркИа, который, как показано в ряде работ [5-7], является экстремальным галофитом с геномом, на 95% идентичным геному Arabidopsis ЛаНапа. Это позволяет использовать клонированные гены-орто-

логи A. thaliana для изучения экспрессии стресс-индуцируемых генов у T. halophila.

Среди всех видов растений, обитающих на суше, галофиты, подобные T. halophila, составляют лишь 2% [1]. Остальные 98% всех видов относятся к гликофитам, которые демонстрируют низкий уровень устойчивости к засолению. Однако по степени устойчивости группа гликофитов ге-терогенна и включает в себя как чувствительные, так и относительно устойчивые виды. Для изучения механизмов адаптации гликофитов к засолению в последнее время активно используются представители рода Plantago, в частности, Planta-go major [8, 9].

В настоящее время получены предварительные данные, согласно которым устойчивость га-лофитов и гликофитов к засолению определяется одними и теми же протекторными механизмами, тогда как наблюдаемые различия в толерантности двух групп растений к стрессу обусловлены сложной системой регуляции экспрессии стресс-зависимых генов [1, 5]. Данная гипотеза не доказана и требует основательной экспериментальной проверки, в частности, необходимости проведения сравнительных исследований функционирования ряда защитных систем, обеспечивающих адаптацию и выживание представителей гало-фитной и гликофитной флоры в условиях интенсивного засоления.

Цель данной работы состояла в изучении стресс-индуцируемых и конститутивных защитных механизмов у экстремального галофита T. halophila и гликофита P. major при засолении. В качестве протекторных механизмов рассматриваются: солеаккумулирующая способность двух видов растений, их способность к синтезу пролина и полиаминов, а также активность внутриклеточной антиоксидантной системы.

МЕТОДИКА

В работе использовали растения: галофит -Thellungiella halophila Mey. (Brassicaceae) и гликофит - Plantago major L. (Plantaginaceae).

Семена растений T. halophila были любезно предоставлены проф. A. Амтман (Университет Глазго, Великобритания); семена P. major - Проблемной лабораторией Брянской государственной инженерно-технологической академии.

Семена перед посевом в перлит стерилизовали в растворе 13%-ной перекиси водорода в этаноле. Семена T. halophila после посева подвергали влажной стратификации в течение семи дней при 4°С. Растения выращивали в перлите при подкормке 1/10 нормы питательной среды Джонсона, модифицированной по Winter [10], в течение двух недель, а затем рассаживали по одному растению в 0.5-литровые сосуды с полной нормой

той же питательной среды. В условиях водной культуры растения выращивали в камере фитотрона при 14-часовом световом периоде и освещенности 350 мкмоль/(м2 с) натриевыми лампами Reflax-250 (Россия). Температура воздуха составляла 23 ± 1°C и 16 ± 1°С (день/ночь), относительная влажность воздуха - 55/70% (день/ночь).

При достижении возраста шести недель -T. halophila - фазы розетки, а P. major - стадии образования 4 -5 настоящих листьев - растения подвергали прогрессирующему засолению. Для этой цели NaCl вносили ступенчато, ежедневно увеличивая его концентрацию на 100 мМ в течение

4 суток до достижения конечной концентрации 400 мМ. Пробы листьев и корней интактных растений отбирали каждые 24 ч в течение 4 суток, фиксировали жидким азотом и хранили при -70°С.

Содержание Cl- определяли потенциометриче-ским методом на ионном анализаторе Orion Research Expandable ionAnalyzer EA940 ("Orion Research", Великобритания) комбинированным хло-ридным электродом модели 96-17B ("Orion Research"). Содержание Na+ и K+ определяли фотометрическим методом на атомно-адсорбционном спектрофотометре Hitachi 207 ("Hitachi", Япония).

Экстракцию и определение свободного пролина проводили по методу Bates [11]. Экстракцию полиаминов из растительного материала и анализ их бензоильных производных проводили методом ВЭЖХ [12].

Определение активности свободной, ион-связанной и ковалентносвязанной гваякол-зависимых пероксидаз (EC 1.11.1.7) и супероксиддисму-тазы (СОД, EC 1.15.1.1) проводили по методу [13].

Концентрацию белка в полученных ферментных препаратах измеряли по методу Esen [14].

Выделение РНК и проведение обратной тран-скрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-

ПЦР). Общую РНК выделяли из растительного материала с использованием RNAeasy Plant Mini Kit ("Qiagen", Германия), согласно протоколу производителя.

Для синтеза кДНК методом обратной транскрипции использовали 5 мкг выделенной РНК, 60 пмоль праймера dT21vn и 200 ед. M-MuLV обратной транскриптазы ("Fermentas", Латвия), согласно протоколу производителя.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в среде объемом 50 мкл следующего состава:

5 ед. Taq-полимеразы, 50 пмоль каждого из специфических праймеров (прямого и обратного), «0.25 мкг кДНК, 0.2 мМ dATP, 0.2 мМ dGTP, 0.2 мМ dTTP, 0.2 мМ dCTP, 60 мМ Трис-HCl (pH 8.5), 1.5 мМ MgCl2, 25 мМ KCl, 10 мМ 2-мер-каптоэтанол, 0.1%-ный Тритон Х-100. ПЦР проводили в амплификаторе модели PTC1160 ("BioRad", США).

Концентрация NaCl, мМ

Рис. 1. Динамика накопления ионов натрия (а, б) и хлора (в, г) растениями Thellungiella halophila (а, в) и Plantago major (б, г) при действии постепенного засоления. 1 - корни, 2 - листья.

Конструирование праймеров для проведения ПЦР генов биосинтеза и деградации пролина и полиаминов. Специфические праймеры конструировали с использованием кДНк последовательностей соответствующих генов A. thaliana и P. major из базы данных Национального центра биотехнологической информации США, Национальной медицинской библиотеки (NCBI, http://www.ncbi. nlm.nih.gov/) в среде Vector NTI 9.0.0, InforMax. Последовательности праймеров и количество пар оснований амплифицируемого участка представлены в таблице. Проверка продуктов ПЦР на соответствие количеству пар оснований амплифицируемого участка последовательности гена проводили при помощи агарозного гель-электрофореза. В качестве контроля уровня транскриптов генов использовали экспрессию ортолога гена актина 2 A. thaliana и актина 1 P. major.

Данные получены в трех биологических и трех аналитических повторн

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком