ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2015, № 3, с. 258-264
БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 576.53
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СУБПОПУЛЯЦИЙ МЕЗЕНХИМНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА И ЗАРОДЫШЕВОЙ ПЕЧЕНИ, РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ПО ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ
К 5-ФТОРУРАЦИЛУ
© 2015 г. О. В. Паюшина, Н. Н. Буторина, О. Н. Шевелева, Е. И. Домарацкая
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334 Москва, ул. Вавилова, 26
E-mail: payushina@mail.ru Поступила в редакцию 13.10.2014 г.
Показано, что воздействие 5-фторурацила (5-ФУ) на мезенхимные стромальные клетки (МСК) костного мозга и зародышевой печени крысы обогащает популяцию клетками со сниженным про-лиферативным потенциалом. Установлено, что резистентные к 5-ФУ МСК из костного мозга в ходе пассирования теряют потенции к дифференцировке в остеогенном направлении быстрее, а из печени зародыша — медленнее, чем чувствительные к 5-ФУ клетки.
DOI: 10.7868/S0002332915030091
Изучение мезенхимных стромальных клеток (МСК), впервые описанных Фриденштейном (Friedenstein et al., 1976) как колониеобразующие единицы фибробластов (КОЕ-Ф), — актуальное направление клеточной биологии. В настоящее время они определяются как адгезивные к пластику клетки со специфическим антигенным фенотипом, способные к остео-, адипо- и хондроге-незу (Dominici et al., 2006). Одна из малоисследованных проблем — установление структуры гистогенетического ряда МСК, представляющих собой гетерогенную популяцию. Методическим подходом к ее исследованию может служить применение цитотоксических препаратов избирательного действия, поражающих клетки в зависимости от степени их зрелости или фазы клеточного цикла. К таким препаратам относится, в частности, 5-фторурацил (5-ФУ) — циклоспеци-фический агент, оказывающий цитотоксическое действие на протяжении всех стадий клеточного цикла. Как известно, в кроветворном диффероне 5-ФУ элиминирует коммитированные клетки-предшественники, не действуя на стволовые клетки с высокой способностью к самоподдержанию (van Zant, 1984; Домарацкая и др., 1995; Ivanovic et al., 1999). Имеющиеся данные позволяют предполагать, что и в стромальном диффероне этот препарат селективно удаляет продвинутые в дифференцировке клетки, сохраняя наиболее примитивные (Старостин и др., 1995; Conget et al., 2001; Wang et al., 2006). Однако действие 5-ФУ на стромальные клетки изучено в меньшей степени, чем на кроветворные, и нуждается в дополнительном исследовании. Особенно интересно сравнить влияние 5-ФУ на МСК, полученные на
разных стадиях индивидуального развития. Это может дать новую информацию о формировании популяции МСК в онтогенезе.
Проведенная нами ранее оценка чувствительности к 5-ФУ стромальных клеток из печени зародышей и зрелого костного мозга крысы выявила в обоих органах субпопуляцию резистентных к нему клоногенных МСК (Паюшина и др., 2006). Цель работы — анализ способности устойчивых и чувствительных к 5-ФУ МСК из данных источников к остеогенной и адипогенной дифференци-ровке и оценка степени сохранения этих потенций в ходе пассирования культуры.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использованы самки крыс Wistar массой 260—280 г и их 16-суточные плоды. Первым днем эмбриогенеза считали день обнаружения сперматозоидов во влагалищном мазке. Клетки выделяли из костного мозга половозрелых животных или печени плодов.
Вводили животным внутрибрюшинно 5-ФУ (Sigma, США) в дозе 150 мг/кг за 1 сут до взятия клеток либо инкубировали свежевыделенную клеточную суспензию с концентрацией 107 кл./мл в среде a-MEM с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (ЭТС) и 50 мкг/мл 5-ФУ 2 ч при 37°С с последующей отмывкой трехкратным центрифугированием. Контролем служили клетки от крыс, которым не вводили препарат, или клетки, проинкубированные в такой же среде, но без 5-ФУ.
Клетки культивировали при 37°С и 5% CO2 в среде a-MEM с добавлением 10% ЭТС, L-глута-
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СУБПОПУЛЯЦИЙ
259
Таблица 1. Влияние 5-ФУ на эффективность клонирования колониеобразующих единиц фибробластов и активность ЩФ в образуемых ими колониях
Вариант Число колоний на 106 клеток ЩФ-, % <50% ЩФ+-клеток, % >50% ЩФ+-клеток, %
in vitro без 5-ФУ 3.89 ± 0.41 50.44 ± 3.67 40.76 ± 3.61 8.80 ± 3.6
Костный мозг 5-ФУ 1.27 ± 0.07*** 39.16 ± 2.38* 51.87 ± 2.48* 8.97 ± 1.31
in vivo без 5-ФУ 6.53 ± 0.74 18.56 ± 5.15 66.36 ± 3.75 15.08 ± 3.13
5-ФУ 0.66 ± 0.46*** 0.00 ± 16.33 23.51 ± 22.62 76.49 ± 22.62**
Печень in vitro без 5-ФУ 9.61 ± 0.41 93.05 ± 2.08 6.75 ± 2.08 0.2 ± 0.21
5-ФУ 2.88 ± 0.27** 71.55 ± 6.65* 28.24 ± 6.65** 0.21 ± 0.22
Примечание. ЩФ — щелочная фосфатаза, 5-ФУ — 5-фторурацил, для табл. 1 и 2. *p < 0.05. **p < 0.01. ***p < 0.001.
мина, антибиотика-антимикотика, пенициллина и стрептомицина, сменяя среду через 7 сут после посева. Для оценки числа и потенций к остеоген-ной дифференцировке КОЕ-Ф первичную культуру фиксировали 10%-ным формалином на PBS через 11 (костный мозг) или 8 сут (печень зародышей) после посева и цитохимически выявляли активность щелочной фосфатазы (ЩФ) в образовавшихся колониях. Пассирование клеток проводили по достижении конфлюэнтного монослоя, снимая их 0.25%-ным раствором трипсина с ЭДТА и рассевая в соотношении 1 : 2.
Остеогенную дифференцировку клеток индуцировали путем культивирования в среде a-MEM с 5% ЭТС, 10-8 M дексаметазона, 50 мкг/мл 2-фос-фо^-аскорбата и 10 мМ Р-глицерофосфата натрия в течение 14—21 сут, а адипогенную — путем культивирования в среде a-MEM с 10% ЭТС, 10-6 M дексаметазона, 0.2 мМ индометацина, 0.01 мг/мл инсулина и 0.5 мМ 3-изобутил-1-метилксантина в течение 11—16 сут.
Для анализа остеогенеза выявляли ЩФ методом азосочетания прочного красно-фиолетового FRV с нафтолом AS-BI и визуализировали отложения солей кальция путем окрашивания культур ализариновым красным S. Результаты индукции адипогенеза оценивали, окрашивая нейтральные жиры в клетках жировым красным О. Ядра докрашивали гематоксилином. Результаты подвергали статистической обработке (Стрелков, 1999).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Спонтанная экспрессия ЩФ в первичной культуре. Предыдущие исследования (Старостин и др., 1995; Паюшина и др., 2006) показали, что часть КОЕ-Ф, содержащихся в костном мозге и зародышевой печени, обладают устойчивостью к воздействию 5-ФУ при обработке им in vitro, а в
случае костного мозга — также и при введении препарата животному. Инъекция 5-ФУ беременным самкам ведет к гибели подавляющего большинства КОЕ-Ф в печени зародышей, вероятно, ввиду его высокой эмбриотоксичности. В связи с этим влияние 5-ФУ на стромальные клетки зародышевой печени было проанализировано только in vitro, тогда как к клеткам костного мозга были применены оба способа обработки препаратом.
Для предварительной оценки потенций к остео-генной дифференцировке резистентной к 5-ФУ популяции клеток в сравнении с чувствительной к нему были проанализированы колонии, образованные в первичной культуре КОЕ-Ф, обработанными или не обработанными 5-ФУ. Как следует из табл. 1, воздействие 5-ФУ на КОЕ-Ф из обоих органов несколько повышало долю колоний, содержащих ЩФ+-клетки, что может свидетельствовать о преимущественном выживании клоногенных клеток с потенциями к остеогенезу. Их положение в стромальном диффероне не вполне ясно. Имеющиеся в литературе данные об активности ЩФ в различных субпопуляциях МСК костного мозга человека, свидетельствующие о меньшей скорости пролиферации клеток, содержащих этот фермент, более слабой экспрессии в них генов, связанных с клеточным циклом и плюрипотентностью, а также ограниченной способности к адипо- и хондрогенезу, указывают на их более продвинутое положение в гистогене-тическом ряду по сравнению с клетками, лишенными ЩФ (Kim et al, 2012). Возможно, наряду с наиболее примитивными покоящимися МСК эта субпопуляция коммитированных к остеогенезу клеток из-за сниженной пролиферативной активности более резистентна к 5-ФУ, чем активно пролиферирующие мультипотентные МСК. В то же время нельзя исключить, что повышенное содержание клеток с положительной реакцией на
ЩФ среди МСК, обработанных 5-ФУ, связано с избирательной элиминацией клеток, коммитиро-ванных к другим направлениям дифференциров-ки, утративших способность к остеогенезу и сопутствующую ей активность ЩФ.
Остеогенная и адипогенная дифференцировка МСК в пассируемой культуре. Чтобы охарактеризовать дифференцировочный потенциал субпопуляций МСК, различающихся по чувствительности к 5-ФУ, и прояснить их гистогенетические взаимоотношения, мы провели эксперименты по индукции остеогенной и адипогенной дифферен-цировки МСК из зрелого костного мозга и зародышевой печени, переживших воздействие 5-ФУ и, следовательно, резистентных к нему, либо не обработанных 5-ФУ контрольных клеток, включающих в себя как устойчивую, так и чувствительную к этому препарату субпопуляции.
Подсчет жировых клеток, образовавшихся после 13 сут культивирования МСК костного мозга на первом пассаже в среде, способствующей адипогенной дифференцировке, выявил тенденцию к несколько меньшей выраженности потенций к адипогенезу у клеток, обработанных 5-ФУ in vitro, по сравнению с не обработанными им МСК (число адипоцитов составляло соответственно 442.73 ± 56.36 и 582.73 ± 53.64 клеток на 1 см2). В ходе пассирования клеток этих двух популяций различия в их способности к адипогенезу исчезали: на четвертом пассаже клетки, подвергнутые воздействию 5-ФУ, через 16 сут индукции образовывали 550 ± 50.91 адипоцитов на 1 см2, а не обработанные им клетки — 530.45 ± ± 59.55 адипоцитов на 1 см2.
При этом резистентные и чувствительные к 5-ФУ МСК демонстрировали значительные различия в потенциях к дифференцировке в остео-генном направлении. Обработанные им клетки на первом пассаже формировали через 19 сут достоверно (p < 0.01) больше костных узелков, чем не обработанные (соответственно 7.21 ± 0.62 и 4.54 ± ± 0.62 узелков на 1 см2). Эти узелки были крупнее и плотнее, а реакция на ЩФ в них, как правило, была интенсивнее (рис. 1а, б).
Анализ дифференцировки на пятом пассаже показал, что потенции к остеогенезу у клеток обеих субпопуляций ослаблены по сравнению с таковыми на первом пассаже. После 21 сут индук
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.