БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1996, том 22, № 6, с. 408^14
УДК 577.112 [012.6+017]
СТАБИЛИЗАЦИЯ СТРУКТУРЫ ос-ФЕТОПРОТЕИНА САХАРОЗОЙ
© 1996 г. М. Д. Кир кита дзе, II. В. Нарижнева, А. Ю. Томашевский*, С. А. Потехип, В. Н. Уверский#
Институт белка РАН, 142292, Пущино Московской обл.; * Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, 142292, Пущино Московской обл.
Поступила в редакцию 23.11.95 г.
Методами сканирующей микрокалориметрии и флуоресцентной спектроскопии показано, что добавление сахарозы оказывает стабилизирующее воздействие на структуру а-фетопротеина человека (АФП). Наблюдаемый стабилизирующий эффект не устраняется в ходе восьмидневного диализа раствора АФП против буфера, не содержащего сахарозу, однако он может быть существенно ослаблен путем обработки АФП специфическим ферментом - инвертазой, расщепляющей сахарозу на фруктозу и глюкозу. Это может означать, что а-фетопротеин человека способен специфически связывать сахарозу.
Ключевые слова: а-фетопротеин, конформационная стабильность, сахароза, специфическое связывание.
ое-Фетопротеин (АФП) - гликопротеин с молекулярной массой 68 кДа, относящийся к классу онкоэмбриональных белков. Высокое содержание АФП обнаруживается в плазме эмбрионов и новорожденных, тогда как у здоровых взрослых -лишь следовые количества. Повышение концентрации АФП у взрослых отражает разгштие патологии, в частности возникновение гепатоклеточной карциномы и тератобластомы [1]. Установлено, что АФП участвует в различных физиологических процессах, например в транспорте ненасыщенных жирных кислот [2] и эстрогенов [3,4], играет иммуносупрессивную роль [5], регулирует клеточный метаболизм [6] и мультипликацию клеток [7], может эффективно взаимодействовать с макрофагами [51 и Т-лимфоцитами [8]. Показано, что АФП имеет 35% гомологии по первичной структуре с человеческим сывороточным альбумином [9]. Приведенные выше факты указывают на огромную биологическую важность АФП. Однако работ, посвященных изучению структурных свойств этого белка и исследованию воздействия на него различных условий среды, немного. В частности, установлено [10, 11], что понижение рН раствора приводит к трансформации молекулы АФП в компактное денатурированное состояние с выраженной вторичной структурой, известное как состояние расплавленной глобулы [12].
Первоначально целью нашей работы было изучение устойчивости структуры АФП по отношению к тепловой и индуцированной изменением
Сокращения-: АФП - а-фетопротеин. # Автор для переписки.
рН денатурации, а также к разворачиванию мочевиной. Однако в ходе экспериментов было обнаружено принципиальное различие конформаци-онной стабильности свежевыделенного АФП и белка, лиофилизованного из 0.2% раствора сахарозы (сахароза - инертное соединение, часто используемое в качестве криопротектора для хранения коммерческих препаратов белков).
Первые работы по криопротекции белков были проведены почти 35 лет назад, когда Шикама и Ямазаки впервые провели количественный анализ степени денатурации очищенного фермента -каталазы - в процессе замораживания-оттаива-ния [13]. Ими также установлено, что добавление стабилизирующих компонентов может в разной степени восстанавливать активность фермента в процессе оттаивания. В дальнейшем оказалось, что способность к криопротекции не ограничивается определенным классом химических соединений - этим свойством обладают сахара, пол иолы, некоторые соли и белки [13-21]. Показано, что в основе механизма криопротекции лежит способность данного химического соединения образовывать после удаления воды неспецифические комплексы белок-криопротектор. Эти комплексы стабилизированы главным образом водородными связями [22].
В отличие от вышеизложенного результаты, полученные нами в ходе изучения влияния сахарозы на структуру и конформационную стабильность АФП, позволяют предположить, что в нашем случае имеет место специфическое взаимодействие между белком и дисахаридом.
Исследование устойчивости свежевыделенного АФП к изменению температуры и рН среды
Для изучения конформационной устойчивости АФП к изменению температуры и рН среды был использован метод дифференциальной сканирующей микрокалориметрии. На рис. 1 показаны кривые зависимости парциальной молярной теплоемкости от температуры АФП человека при разных значениях рН. Характерный пик поглощения тепла, наблюдаемый на термограммах (в интервале рН 10.4—5.0), связан с кооперативным разрушением жесткой третичной структуры белка [23J. Известно, что анализ калориметрической кривой позволяет определить значения энтальпий - эффективной ЛЯ3**, рассчитываемой по уравнениям Вант-Гоффа, и калориметрической АНКЛ1\ определяемой из площади под калориметрической кривой. Сравнение этих параметров дает возможность сделать вывод о механизме данного конформационного перехода [23]. Действительно, в том случае, когда Д//кал/Н->ФФ = 1, структура белковой молекулы представляет собой единую кооперативную систему, разрушение которой осуществляется без каких-либо промежуточных состояний. При этом в образование этой структуры может быть вовлечена как вся по-липептидная цепь белковой молекулы, так и ее часть. В тех случаях, когда третичная структура белка сформирована из независимых или слабо взаимозависимых кооперативных единиц - доменов, Af/*3* может существенно превосходить д/рфф [24]. Оказалось, что для плавления свежевыделенного АФП отношение значений Д//*^ и ЛТР** близко к 1 (табл. 1). Следовательно, структура молекулы свежевыделенного АФП представляет собой единую кооперативную систему.
В области щелочных и нейтральных рН устойчивость белка к тепловой денатурации остается практически неизменной, при этом значения энтальпий составляют 460-500 кДж/моль (табл. 1). Однако понижение рН до 5.0 вызывает существенную дестабилизацию белка (температура плавления снижается на 11°С, и наблюдается уменьшение энтальпии почти вдвое). Падение энтальпии вызвано, вероятно, ее температурной зависимостью. Инкремент теплоемкости при этом должен составлять величину 0.3 Дж/(г град), которая лежит в диапазоне значений, характерных для глобулярных белков [23]. Дальнейшее понижение рН (до 3.1) приводит к исчезновению пика тепло-поглощения. Ранее нами было показано, что в этих условиях белок находится в состоянии расплавленной глобулы, которая характеризуется отсутствием жесткой третичной структуры [10]. Проводить калориметрические измерения в области значений рН > 10.5 невозможно ввиду сильной агрегации белка. В то же время уменьшение ионной силы со 150 до 10 мМ при рН 10.0 практи-
Рис. 1. Кривые зависимости парциальной молярной теплоемкости от температуры, полученные для свежевыделенного препарата АФП человека при рН 10.4 (7), 8.0 (2), 7.0 (3), 5.0 (4). Использовался РВ8-буфер.
чески не изменяет ни температуру перехода, ни форму кривой.
Следует подчеркнуть, что полученные значения энтальпий тепловой денатурации свежевыделенного АФП достаточно низки для белка такой молекулярной массы (удельная энтальпия меньше 7.4 Дж/г). Обычно плавление таких глобулярных белков не является переходом типа "все или ничего" [24]. Эти факты можно было бы объяснить, предположив, что с самого начала мы имеем дело с частично денатурированным (расплавленным) белком (т.е. часть взаимодействий, поддерживающих третичную структуру, утрачена по каким-то причинам в процессе выделения или хранения) и увеличение температуры приводит к разрушению его остаточной жесткой третичной структуры. Поскольку и полная, и частичная денатурация белковой молекулы приводит к сильному возрастанию скорости протеолиза и увеличению числа протеолитических фрагментов [25], такое предположение легко проверяется с помощью ограниченного протеолиза. Однако оказалось, что АФП обладает чрезвычайно высокой устойчивостью по отношению к протеолитическим ферментам: заметной деградации не наблюдалось даже
Таблица 1. Термодинамические параметры тепловой денатурации свежевыделенного препарата АФП человека
рН Т °С 1 д> ^ дязФФ Л//Г дуэфф/д^ал
кДж/моль
10.4 69.3 510 ±20 480 ± 20 1.06
10.0 69.2 510 ±20 490 ± 20 1.04
8.0 69.8 510 ±20 490 ± 20 1.04
7.0 69.0 490 ± 20 460 ±20 1.07
5.0 58.7 280+ 10 270 ± 10 1.04
Примечание. Измерения проводили в РВ&-буфере. Точность измерения температур составляет ±0.3°С.
230
Л ч
о S 190
1
¥ 150
И
w
О. О 110
300 310 320
330 Г, К
340 350 360
Рис. 2. Разложение функции парциальной молярной теплоемкости препарата АФП, лиофилизованного из 0.2% сахарозы. Измерения проводили в РВЗ-буфере, рН 7.0. Экспериментальная кривая изображена сплошной линией. Результаты разложения представлены штриховыми линиями.
Рис. 3. Кривые зависимости парциальной молярной теплоемкости от температуры, полученные для препарата АФП человека, лиофилизованного из 0.2% сахарозы, при рН 10.0 (7), 7.0 (2), 6.0 (3), 5.0 (4). Использовался РВЭ-буфер.
после 3-часовой инкубации этого белка в присутствии трипсина, химотрипсина и ряда других про-теиназ (данные не приведены) в условиях, когда развернутые белки полностью деградируют. Это, по-видимому, свидетельствует о том, что молекула свежевыделенного АФП не является частично расплавленной. Имеющиеся же особенности поведения этого белка при тепловой денатурации объясняются, вероятно, тем фактом, что структура белка в данном случае формируется при существенном участии лигандов, в частности ненасыщенных жирных кислот.
Исследование устойчивости АФП, лиофилизованного из сахарозы, к тепловой и рН-индуцированной денатурации
Совершенно другая картина наблюдалась при плавлении АФП, лиофилизованного из 0.2% сахарозы с последующим растворением в буфере
PBS (см. "Экспериментальную часть") и диализом в течение 1 сут против того же буфера (рис. 2). Опыт показал существенное изменение профиля калориметрической кривой: в данном случае наблюдается сложный процесс тепловой денатурации, который описывается двумя перекрывающимися по температуре простыми переходами (табл. 2). Помимо этого оказалось, что лиофиль-ное высушивание из раствора сахарозы приводит к стабилизации белка по отношению к тепловой денатурации: заметно увеличиваются температура и энтальпия
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.