ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 2, с. 269-277
УДК 581.1
СТАРЕНИЕ И УТРАТА ВСХОЖЕСТИ СЕМЯН РЖИ СОПРОВОЖДАЕТСЯ УМЕНЬШЕНИЕМ ФРАГМЕНТАЦИИ ЯДЕРНОЙ ДНК ПО ГРАНИЦАМ ПЕТЛЕВЫХ ДОМЕНОВ
© 2004 г. И. О. Андреев, Е. В. Спиридонова, В. А. Кунах, В. Т. Соловьян
Институт молекулярной биологии и генетики HAH Украины, Киев, Украина Поступила в редакцию 25.09.2002 г.
С целью изучения процессов, происходящих в ядре клеток зародышей, исследованы особенности структурной организации ядерной ДНК на уровне петлевых доменов при естественном и ускоренном старении семян ржи. Установлено, что при утрате всхожести происходит снижение интенсивности выщепления петлевых доменов хроматина. Исследование доступности хроматина к ДНКазе I показало, что при старении не происходит существенных преобразований структурной организации хроматина, которые могли бы приводить к уменьшению фрагментации ДНК по границам петлевых доменов. При анализе растворимых ядерных белков обнаружен белок с мол. массой ~31 кД, обладающий нуклеазной активностью, снижающейся при утрате всхожести. Исследование фрагментации ДНК в препаратах дегистонизированых ядер (нуклеоидах) выявило присутствие нуклеа-зы, устойчивой к экстракции 2M NaCl и чувствительной к специфическим ингибиторам ДНК-топо-изомеразы II, активность которой также снижается при старении. Сделан вывод, что снижение активности ферментов, ответственных за выщепление петлевых доменов хроматина, является основной причиной изменений в характере фрагментации ДНК при старении семян.
Secale cereale - старение семян - ускоренное старение - фрагментация ДНК - ядерные нуклеазы -ДНК-топоизомераза II
Проблемы, связанные со старением, в частности, механизмы, лежащие в основе этого процесса, а также возможности его контроля, привлекают неизменное внимание исследователей. Старение семян, изучению отдельных аспектов которого посвящена данная работа, представляет собой интерес в том плане, что в данном случае этот процесс происходит в метаболически малоактивной системе и не связан с активацией специальных генетических программ, как, к примеру, в случае дифференциации или программируемой клеточной смерти.
Старение семян сопровождается постепенной утратой их всхожести, что является следствием совокупности биохимических и физиологических событий. В частности, было обнаружено, что при порче семян снижается эффективность функционирования клеточных систем репарации и анти-оксидантных механизмов [1-3], следствием чего, очевидно, являются пероксидация липидов и по-
Сокращения: MAP - матрикс-ассоциированный регион ДНК, ФМСФ - фенилметилсульфонилфторид. Адрес для корреспонденции: Андреев Игорь Олегович, Киев 143, 03143, Украина, ул. Акад. Заболотного, 150. Институт молекулярной биологии и генетики НАНУ. Факс: 38-0442660759; электронная почта: kunakh@imbg.org.ua
вреждение белков. Предполагается, что одним из факторов снижения жизнеспособности семян может быть активация гидролитических ферментов, приводящая к расщеплению белков и углеводов и накоплению разрывов в ядерной ДНК [4-6]. Однако, вопрос о событиях, происходящих при старении семян в клеточном ядре, остается практически не изученным.
Ранее нами был разработан подход, позволяющий исследовать особенности организации ядерной ДНК в составе хроматина на высших уровнях упаковки. Было показано, что при фракционировании препаратов заплавленных в агарозу ядер или клеток, обработанных белок-денатурирую-щими агентами, такими как додецилсульфат натрия или протеиназа К, выявляются высокомолекулярные фрагменты размером 50-100 т.п.н.. Мы обнаружили, что появление 50-100 т.п.н. фрагментов обусловлено расщеплением ДНК в местах контакта с ядерным матриксом (остаточными белковыми скелетными структурами ядра, устойчивыми к экстракции 2М КаС1), осуществляемым матрикс-ассоциированной нуклеазной активностью, подобной по своим свойствам ДНК-топоизо-меразе II [7, 8]. Характер высокомолекулярной фрагментации, таким образом, отражает особенности организации хроматина на уровне петлевых доменов, формирующихся вследствие кон-
такта ДНК с белками ядерного матрикса. Было установлено также, что изменения функционального состояния клетки, происходящие при развитии растительного организма, сопровождаются изменениями в характере расщепления ядерной ДНК на высокомолекулярные фрагменты, указывая на возможную функциональную значимость этого явления [9].
В данной работе с целью изучения процессов, происходящих в ядре зародышей семян при старении, с использованием разработанного нами ранее подхода изучали расщепление ДНК на высокомолекулярные фрагменты, а также возможные причины, лежащие в основе этого явления.
МЕТОДИКА
Для исследований использованы семена ржи Secale cereale L. сорта Богуславка урожая 1995, 1997 и 2000 гг., предоставленные Институтом физиологии растений и генетики НАН Украины. Ускоренное старение (методика предложена И.И. Бубряком, Институт клеточной биологии и генной инженерии, НАН Украины) осуществляли, помещая семена в мешочке из марли в закрытые герметически сосуды с насыщенным раствором NaCl и выдерживая при температуре 40°С. Для определения всхожести, семена в количестве 100 шт. предварительно замачивали на 8-12 ч, затем помещали на увлажненную фильтровальную бумагу в закрытые чашки Петри и выдерживали 5 сут при 18-20°С. Кривая утраты всхожести при ускоренном старении построена по результатам 4 независимых экспериментов.
Препараты интактных ядер готовили по методике [7]. Зародыши из сухих семян ~40 мкг (2025 семян) растирали в предварительно охлажденной ступке на ледяной бане в 0.3-0.5 мл буфера для выделения (10 мМ Трис-HCl, pH 8.0; 0.3 М маннит; 2 мМ MgCl2; 0.5 мкМ ФМСФ), содержащем 0.5% Тритон X-100. Полученный гомогенат разбавляли тем же буфером до 3-5 мл, фильтровали через 4 слоя марли и центрифугировали в бакет-роторе при 500 g 15 мин при 4°C. Суперна-тант аккуратно сливали, ядерный осадок промывали 2 раза буфером для выделения, осаждая ядра при 500 g 10 мин при 4°C. После последней отмывки осадок ядер ресупендировали в 500 мкл буфера для выделения и быстро смешивали с равным объемом 1% легкоплавкой агарозы при 37°С. Полученную суспензию разливали в охлажденные формы для формирования агарозных блоков. Препараты использовали для дальнейшей работы непосредственно после приготовления.
Оценку нуклеазной активности ядерных белков в ПААГ осуществляли по описанной методике [10, 11] с небольшими модификациями. Образ-
цы готовили следующим образом: к 25 мкл суспензии ядер (~0.5 х 106 ядер) добавляли равный объем 2х буфера для нанесения образцов (62.5 мМ Трис-HCl, pH 6.8; 1% ДДС-Na; 10% глицерин) тщательно перемешивали и инкубировали при 37°С 15 мин после чего загружали в лунки 15% ПААГ. В разделяющий гель вносили одноце-почечную ДНК: 50 мкг/мл денатурированной ДНК тимуса теленка ("Sigma", США). Электрофорез проводили в Трис-глициновом буфере (pH 8.3) при силе тока 20 мА в течение 15-16 ч при 8°С. После электрофореза гель промывали 2 раза по 30 мин при комнатной температуре 25% изопро-панолом, 10 мМ Трис-HCl, pH 7.5, затем 2 раза по 30 мин 10 мМ Трис-HCl, pH 7.5; 1 мМ ЭДТА; 1 мМ MgCl2; 1 мМ CaCl2. После отмывки гель инкубировали 1-12 ч (в зависимости от эффективности нуклеазного гидролиза ДНК) при 37°С и окрашивали бромистым этидием (15 мин в растворе, содержащем 1 мг/мл бромистого этидия, с последующей отмывкой 30 мин в 1 мМ MgCl2). Нуклеаз-ная активность выявляется в ультрафиолетовом свете в виде неокрашенных полос. Далее для оценки количества белка гель окрашивали Ку-масси CBB G-250 [12].
Обработку ДНКазой I проводили, инкубируя аликвоты суспензии ядер в буфере для выделения объемом по 100 мкл в присутствии различных количеств ДНКазы I ("Sigma") (концентрация фермента указана в подписях к рисункам) в течение 5 мин при 20°С. Для остановки реакции в реакционную смесь добавляли ЭДТА до кон. конц. 50 мМ и, затем, 100 мкл 1% легкоплавкой агарозы при 37°С, тщательно перемешивали и помещали пробирки на лед, давая агарозе застыть. Застывшие агарозные блоки обрабатывали буфером для лизиса.
Дегистонизированные ядра (нуклеоиды) получали путем инкубации заплавленных в агарозу ядер в буфере для экстракции (2 М NaCl, 10 мМ Трис-HCl, pH 8.0; 1 мМ ЭДТА; 0.5 мкМ ФМСФ), выдерживая агарозные блоки в буфере при 4°C 2 раза по 30 мин, с заменой экстрагирующего буфера на свежий. После этого препараты отмывали (5 х 20 мин) тем же буфером без NaCl.
Индукцию эндогенного расщепления в препаратах ядер и нуклеоидов осуществляли путем инкубации агарозных блоков в течение 15 мин при 37°С в буфере для расщепления следующего состава: 10 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ MgCl2; 0.5 мкМ ФМСФ. Ингибиторы ДНК-топо-изомеразы II этопозид (VP-16) вносили в инкубационную смесь до конечной концентрации 75 мкМ; сурамин (Bayer 205) - 100 мкМ.
Лизис образцов перед фракционированием производили инкубируя агарозные блоки, содержащие нуклеоиды, в буфере для лизиса: 10 мМ Трис-HCl, pH 8.0; 50 мМ ЭДТА; 1% ДДС-Na;
200 мкг/мл протеиназы К, в течение 2 ч или более при температуре 55°С. Фракционирование ДНК при помощи гель-электрофореза в инвертируемом электрическом поле проводили в 1% агарозе в буфере 0.5х TBE при напряженности электрического поля 4 В/см на протяжении 42 ч. Интервал пульсации увеличивался экспоненциально от 3 до 50 с, соотношение "вперед"/"назад" - 3:1. Данный режим позволяет практически линейно разделять фрагменты ДНК в диапазоне до 500 т.п.н. [13].
Для определения количества нерасщепленной ДНК, остающейся на старте, агарозные блоки после фракционирования извлекали из лунок геля, помещали в пробирки и инкубировали при 65 °С в присутствии 10 мМ ЭДТА, 1% ДДС-Na, 200 мкг/мл протеиназы К в течение 2 ч. Затем расплавленную агарозу со стартовой ДНК заливали в лунки свежего 1% геля и после застывания фракционировали ДНК при постоянном напряжении 5-7 В/см в течение 2-4 ч.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Расщепление ДНК на высокомолекулярные фрагменты в препаратах изолированных ядер при естественном и ускоренном старении семян. На рис. 1 представлены результаты фракционирования препаратов ядер, изолированных из зародышей семян рж
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.