ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 2, с. 287-296
УДК 581.1
СТАТИСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ, МАРКИРУЮЩИЕ МОРФОГЕНЕЗ В КАЛЛУСНЫХ КУЛЬТУРАХ
ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ
© 2004 г. М. И. Соболева, И. В. Логинов*
Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва * Московская сельскохозяйственная академия им. К.А. Тимирязева, Москва Поступила в редакцию 17. 02. 2003 г.
Пассирование каллусных культур яровой мягкой пшеницы без разделения каллусов на экспланты, способствовавшее строгому сохранению линии "один изолированный зародыш - один каллус", позволило установить следующие корреляции. Внутри каждого отдельного сорта ТгШеит aestivum Ь. и в ряду сортов, выстроенных в порядке увеличения частоты встречаемости эмбриогенных каллусов, наблюдались достоверные на 95%-ном уровне значимости положительные корреляции между активностью пролиферации каллусных клеток и частотой встречаемости эмбриогенных каллусов. Обнаружена также достоверная на 95%-ном уровне значимости внутривидовая корреляция между множественной регенерацией растений из каллусов и общей кустистостью донорных растений. Определена значимость различных статистических характеристик каллусных культур для предварительной оценки эффективности морфогенеза на ранних этапах культивирования. Частоты каллусогенеза и ростовые кривые для случайно выбранных каллусов, без учета их морфогенной способности оказались не информативны. Статистическими характеристиками, маркирующими морфогенную способность каллусов пшеницы, являлись увеличивающиеся коэффициенты вариации сырого веса первичных каллусов, более крупные размеры и больший прирост биомассы у потенциально морфоген-ных каллусов.
ТгШеит aestivum Ь. - каллусы - сырой вес - коэффициент вариации - прирост биомассы - общая кустистость - множественная регенерация - корреляции
Многолетние разносторонние исследования морфогенеза интактных растений позволили установить, что процесс образования новой формы есть результат координированного действия активной пролиферации, роста и дифференциации клеток в очагах органогенеза и на ультраструктурном уровне часто определяется динамическими перестройками тубулинового и актинового цитоскелетов [1, с. 351, 2-4]. Формообразование как органов побега, так и корневой системы у растения начинается с активации делений клеток в определенной плоскости [1, с. 383, 2, 5]. То есть на молекулярном уровне морфогенез, по-видимому, сопряжен с активностью пролиферации. Несмотря на общий генотип донорного растения и взятого от него экспланта, закономерности морфогенеза, характерные для интактного растения, могут нарушаться в специфичных условиях культивирования in vitro. Соотношение активности пролиферации неорганизованной массы каллус-
Адрес для корреспонденции: Соболева Марина Игоревна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений РАН. Факс: 07 (095) 977-80-18.
ных клеток и частоты морфогенеза практически не изучалось. В частности, для каллусных культур пшеницы такие данные редки и противоречивы. В одних работах указывается, что эмбриоген-ный каллус растет быстрее, чем неэмбриогенный [6], в других - что активность пролиферации и частота морфогенеза коррелируют не всегда [7]. То есть вопрос о необходимости сопряжения генетических механизмов пролиферации и морфогенеза в культурах in vitro, например, у злаков, остается открытым.
Учитывая практические потребности технологий клеточной селекции в повышении эффективности морфогенеза, в частности у злаков, представляют интерес работы, устанавливающие и другие гомологии между соответствующими процессами in vivo и in vitro, что позволяет судить о генетической общности исследуемых процессов, несмотря на столь различные условия. Подобные работы способствуют также более полному выявлению разнообразия генетических цепей, участвующих в морфогенезе растений, и разработке на основе установленных гомологий надежных статистических критериев, имеющих предсказательную силу в оценке эффективности
будущего морфогенеза in vitro. К сожалению, в специальной литературе подобные работы встречаются редко. Следует отметить исследования Дунаевой с соавт. [8-10], выполненные на ячмене, Смоленской и Сурикова [11, 12] - на картофеле. Так в работе Дунаевой [10] на дигаплоидных линиях двух сортов ячменя рассматривается возможность гомологии механизмов кущения полевых растений и побегообразования у каллусов in vitro. У картофеля также отмечается взаимосвязь между пазушным ветвлением и побегообразованием in vitro [11]. Нам не удалось обнаружить подобных публикаций для пшеницы, но в случае установления надежной корреляции между процессами кущения и регенерации растений в клеточных культурах общую кустистость сорта можно будет использовать как критерий отбора сортов, эффективных для клеточной селекции. Кроме этого, в физиологии яровой мягкой пшеницы известно явление подавления главным побегом развития побегов кущения [13, с. 52], а для каллусных культур пшеницы описано явление прорастания незрелого зародыша (т. е. формирования главного побега) на каллусогенных средах [14, с. 46]. Взаимосвязь же между прорастанием незрелого зародыша и морфогенезом из адвентивных почек в каллусных культурах практически не изучалась.
В настоящей работе авторы ставили перед собой задачу исследования взаимосвязи процесса побегообразования in vitro в каллусных культурах яровой мягкой пшеницы с кущением интакт-ных растений, с процессом прорастания незрелых зародышей на каллусогенной среде и с активностью пролиферации каллусных клеток. На основе полученных данных рассматривалась возможность выработки статистических критериев, имеющих предсказательную силу в отношении мор-фогенной способности каллусов.
МЕТОДИКА
Объектами исследований служили семь сортов яровой мягкой пшеницы: Таежная, Опал, Целинная Юбилейная, Лютесценс 62, Саратовская 29, Энита, Иволга и линия Фотос. Подбор сортов был случайным. Донорные растения выращивали в вегетационных сосудах (по 12 растений в каждом) в условиях теплицы с апреля по июнь 1997, 1999 и 2002 г. при естественном освещении и температуре и при строго равных объемах и составе почвы, условиях полива и подкормки. Глубина заделки семян составляла 2 см. Выборка донорных растений составляла 24-36 штук в разные годы выращивания. В ходе вегетации определяли долю кустящихся растений и общую кустистость у всех исследуемых сортов, начиная с фазы третьего листа. Параметр "кустистость сорта" рассчитывали
как отношение максимального числа побегов в фазе кущения к общей выборке растений.
Незрелые зародыши изолировали из зерновок средней части главного колоса на 14-е сутки после зацветания и высаживали щитком вниз в чащ-ки Петри на агаризованную среду MS с добавлением 150 мг/л L-аспарагина и 2 мг/л 2.4-Д по 1015 эксплантов на чашку. Состав среды не меняли в ходе трех месяцев культивирования. Чашки Петри инкубировали в камере фитотрона при температуре 26 ± 1°С, освещении 3 клк, фотопериоде 16/8 часов и относительной влажности 70 ± 5%. Пассирование культур осуществляли каждые 28 сут, не разделяя каллусы на экспланты.
Общую выборку изолированных незрелых зародышей делили на три части, каждая из которых составляла 75-330 шт. в разные годы исследования. Одну из параллельных культур каждого сорта использовали для построения ростовых кривых первичных каллусов, вторую - для исследования прорастания зародышей, третью - для анализа морфогенеза in vitro. Частоту каллусоге-неза на начальных этапах развития культур рассчитывали на 14-е сутки культивирования как среднюю из всех трех культур данного сорта. При построении ростовых кривых первичных каллусных культур не менее 10 случайно выбранных каллусов каждого сорта взвешивали на аналитических весах и рассчитывали средний сырой вес каллуса в 4-8 временных точках нулевого пассажа. Проростки в этих культурах удаляли на 5-7-е сутки культивирования. Во втором наборе каллусных культур прорастание зародыша прослеживали без какого-либо вмешательства в течение нулевого пассажа. Рассчитывали доли каллусов с развитым проростком в конце третьей недели культивирования. В третьем наборе каллусных культур проводили исследования различных этапов морфогенеза. Проростки в этих культурах удаляли на шестые сутки культивирования. При этом каллусы пересаживали на свежую среду, а чашки Петри до и после пересадки из них каллусов взвешивали. Вычисленный средний сырой вес одного каллуса каждого сорта служил отправной точкой при аналогичных расчетах прироста сырого веса каллусов в следующих пассажах. Частоты морфогенеза и регенерационной способности рассчитывали как отношение количества каллусов с адвентивными почками или с развитыми ре-генерантами к общей выборке каллусов и выражали в процентах. Множественную регенераци-онную способность рассчитывали как отношение общего количества растений-регенерантов к общему числу каллусов с адвентивными почками.
Для расчета коэффициентов корреляции между средним приростом сырого веса каллуса и частотой появления каллусов с адвентивными почками для каждого сорта было отобрано по 5-7 ча-
Таблица 1. Статистические характеристики первичных каллусных культур
Сорта Частота каллусогенеза, % от количества эксплантов Сырой вес каллусов на 28-е сутки культивирования Коэффициенты вариации сырого веса каллусов, %
1997 1999 2002 1999 2002 1999 2002
7 сут 28 сут 7 сут 28 сут
Энита - 95.5 ± 2.2 97.9 ± 1.2 60.8 ± 1.1 105.0 ± 9.4 7.1 10.5 65.3 85.9
Иволга - 92.4 ± 0.9 100 56.0 ± 2.5 101.1 ± 6.2 4.3 21.9 37.3 69.0
Таежная 88.4 ± 4.4 92.6 ± 6.1 100 93.6 ± 6.1 88.1 ± 5.6 18.9 32.5 45.1 79.1
Целинная Юбилейная 79.9 ± 8.3 98.4 ± 1.6 - 53.3 ± 2.9 - 68.0 18.4 - -
Саратовская 29 - - 98.5 ± 1.1 - 75.8 ± 1.1 - - 17.9 9.0
Фотос 95.2 ± 3.8 73.9 ± 9.9 98.6 ± 1.3 67.8 ± 1.5 70.0 ± 7.8 18.7 18.2 48.7 35.7
Лютесценс 62 - 79.1 ± 8.7 97.9 ± 2.0 80.4 ± 1.0 112.4 ± 5.3 12.6 6.8 42.2 40.6
Опал - - 100 - 112.9 ± 8.6 - - 36.1 61.9
Примечание. Прочерк - отсутствие данных.
шек с одинаковым (по 15 шт.) числом каллусов. В каждой чашке вычисляли долю каллусов с адвентивными почками и средний прирост сырого в
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.