ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2011, том 58, № 5, с. 766- 773
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1:581.575
СТИМУЛИРОВАНИЕ ЗАЩИТНЫХ РЕАКЦИЙ У РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ IN VITRO С ПОМОЩЬЮ ЭКЗОГЕННЫХ СТЕРОИДНЫХ ГЛИКОЗИДОВ В УСЛОВИЯХ АБИОТИЧЕСКОГО СТРЕССА © 2011 г. Л. А. Волкова, В. В. Урманцева, А. Б. Бургутин, С. Н. Маевская, А. М. Носов
Учреждение Российской академии наук Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва
Поступила в редакцию 13.05.2010 г.
С целью изучения биологической активности фуростаноловых гликозидов (ФГ) в качестве элиси-торов, а также для выявления возможных механизмов их действия, исследовали антирадикальные свойства этих соединений и их влияние на растения картофеля (Solanum tuberosum L.) in vitro в условиях абиотического стресса. ФГ стимулировали адаптивные реакции, связанные с активацией гваякол-зависимой пероксидазы и снижением уровня перекисного окисления липидов (ПОЛ). В нормальных условиях через 30 мин после обработки растений ФГ в концентрации 4.5 мкМ наблюдали снижение уровня ПОЛ и повышение активности гваякол- и аскорбат-зависимой пероксидаз; при этом активность каталазы и супероксиддисмутазы (СОД) оставалась без изменений. Через трое суток после обработки ФГ снижение уровня ПОЛ в листьях картофеля составляло 20—60%, в корнях — 50%. В условиях действия стрессоров: параквата (11 суток) и гипотермии (28 суток) уровень ПОЛ в варианте с ФГ был ниже на 20—40% по сравнению с действием одних только стрессовых факторов, что свидетельствует об элиситорных свойствах ФГ. Антирадикальные свойства ФГ по отношению к гид-роксил-радикалу в реакции окисления дезокси-Б-рибозы в водной среде, без гомогената, проявлялись в диапазоне концентраций от 4.5 до 65 мкМ; по отношению к анион-радикалу кислорода эффект был незначителен. Предполагается, что стимуляция защитных реакций от внешних воздействий в растениях картофеля при экзогенной обработке ФГ осуществляется через генерацию активных форм кислорода.
Ключевые слова: Solanum tuberosum — растения in vitro — фуростаноловые гликозиды — паракват — гипотермия — перекисное окисление липидов — пероксидаза — супероксиддисмутаза — активные формы кислорода — антирадикальные свойства
ВВЕДЕНИЕ
В последнее время активно развиваются методы защиты растений, основанные не на уничтожении патогенов (использовании пестицидов), а на повышении иммунного потенциала растений. Подобные методы связаны, прежде всего, с использованием индукторов естественной устойчивости — элиситоров. Возникающая при этом относительная устойчивость обусловлена экспрессией ряда защитных генов, является неспецифичной и распространяется по всем растительным тканям [1, 2]. Поскольку действие элиситоров не всегда вызывает достаточный уровень индуцирования устойчивости, в последнее время активизировались попытки усовершенствовать их защитное действие [2].
Сокращения: ФГ — фуростаноловые гликозиды; ТБК-АП — комплекс тиобарбитуровой кислоты и взаимодействующих с ней активных продуктов; СОД — супероксиддисмутаза. Адрес для корреспонденции: Волкова Людмила Александровна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Электронная почта: la-volkova@yandex.ru
К природным веществам, стимулирующим адаптивные механизмы у растений, можно отнести фуростаноловые гликозиды (ФГ), выделенные из культуры клеток Dioscorea deltoidea. У животных эти соединения проявляют иммуномодулирующую, анаболическую, гепатопротекторную, овуляторную активность [3]. На культуре клеток картофеля было показано, что ФГ в низких концентрациях могут действовать как элиситоры, способные повышать устойчивость растительных клеток к окислительному стрессу. ФГ вызывали в каллусной культуре изменение пигментного состава, увеличение активности антиокислительных ферментов и репарационных систем, приводящих к снижению уровня перекисного окисления липидов (ПОЛ) и к повышению выживаемости клеток картофеля in vitro [4]. На интактных растениях томатов было показано проявление защитного действия ФГ в условиях биотического стресса [5]. Действие этих соединений на растения в условиях абиотического стресса практически не изучено.
В литературе есть сведения, что ФГ, имеющие подвижный атом водорода у гемикетальной гид-
роксильной группы при С-22, в водном растворе обладают свойствами стабильных радикалов, которые способны тормозить развитие свободнора-дикальных процессов [6]. В то же время, их антирадикальные свойства по отношению к анион-радикалу кислорода и гидроксил-радикалу не исследованы.
Для создания в растениях окислительного стресса обычно используют абиотические стрессовые воздействия, например, обработку пара-кватом или гипотермию. Повреждение клеток при таких воздействиях в значительной степени обусловлено действием образующихся активных форм кислорода (АФК), которые вызывают повреждения мембран в результате инициирования процессов ПОЛ [7]. Активацию ПОЛ рассматривают как одно из главных звеньев в механизме развития стресса [7, 8]. Ряд авторов указывают, что продукты ПОЛ и АФК также играют роль сигнальных молекул, обеспечивающих экспрессию редокс-чувствительных генов, многие из которых необходимы для защиты от окислительного стресса [8—10].
Целью настоящей работы было исследование роли ФГ в адаптации растений к окислительному стрессу, индуцированному паракватом и гипотермией, а также влияние ФГ на уровень активности антиокислительных ферментов в нестрессовых условиях.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования служили растения картофеля сорта Дезире, поддерживаемые в пробирочной культуре на агаризованной среде с половинной дозой солей по Мига8Ы§е и 8коо§ [11] и 1% сахарозой. Исходные растения были предоставлены проф. Г.А. Романовым (ИФР РАН). Растения культивировали на свету (освещенность 2500—3000 лк, лампы ЛБ-80) при фотопериоде 16 ч и температуре 24—26°С в камере фитотрона ИФР РАН. Для анализа использовали 4-недельные растения.
Степень повреждения мембран при окислительном стрессе определяли по уровню ПОЛ, а уровень антиоксидантной защиты — по активности "гваяколовой" пероксидазы. Для проверки предположения о механизмах действия экзогенных ФГ на растительные клетки, регистрировали изменения уровня АФК в реакции образования формазана. Для определения возможного анти-оксидантного действия ФГ исследовали их антирадикальные свойства в отношении анион-радикала кислорода и гидроксил-радикала.
Применение индукторов: ФГ, параквата и гипотермии. Используемые для экспериментов ФГ были выделены из водного экстракта лиофильно-высушенной культуры клеток Бюзсогва йе1Шйга
Wall (штамм ИФР ДМ-0.5). Они представляли собой смесь фуростаноловых гликозидов: дельтози-да и протодиосцина в соотношении 2 : 3 с уровнем очистки 85% [5]. В экспериментах использовали ФГ в концентрации 4.5 мкМ, применявшейся в работе [5] на растениях томатов.
Время обработки составляло 5 мин, поскольку это минимальный срок обработки, после которого регистрировали реакцию клеток растений на воздействие индуктора по изменению активности гваякол-зависимой пероксидазы.
Пробирочные растения картофеля сорта Дези-ре обрабатывали ФГ в течение 5 мин, заливая стерильный раствор препарата в пробирки до полного погружения растения в раствор. После 5 мин экспозиции раствор сливали. Реакцию растений на последействие ФГ изучали как на коротких временных интервалах — от 5 до 90 мин после обработки, так и на более длительных — до 9 дней.
Кроме того, исследовали динамику развития пролонгированной реакции растений в течение 4—11 дней после кратковременного действия параквата в концентрациях 50 и 500 мкМ. Обработку индуктором проводили, заливая растения на 5 мин раствором параквата. При исследовании совместного действия ФГ и параквата вначале проводили обработку растений раствором ФГ (4.5 мкМ) в течение 5 мин, а затем, после удаления раствора, обрабатывали паракватом также в течение 5 мин. Контролем служили исходные растения, не подвергнутые воздействиям индукторов.
Для изучения участия ФГ в реакциях растений на непрерывное действие стресс-фактора после обработки раствором ФГ (4.5 мкМ) растения помещали на 28 суток на свет в условиях гипотермии (4°С).
Для определения активности пероксидазы и уровня ПОЛ пробы фиксировали жидким азотом в отмеченные моменты времени и до анализа хранили при температуре —70°С.
Определение активности ферментов.
Активность гваякол-зависимой пероксидазы определяли по изменению оптической плотности реакционной смеси при 470 нм, содержавшей в 3 мл смеси: 60 мМ К-№-фосфатный буфер (pH 5.5), 0.4% гваякол, 10 мМ Н2О2 и 500 мкл "ферментативного" экстракта, полученного после гомогенизации листьев в 0.15 М фосфатном буфере [12]; активность фермента рассчитывали по количеству окисленного гваякола и выражали в мкмоль или нмоль/(г сырой массы мин) c учетом коэффициента молярной экстинкции для окисленного гваякола (б = 26.6 (мМ см)-1).
Активность каталазы определяли по количеству разложившейся перекиси (нмоль/(г сырой массы мин)) с учетом коэффициента молярной экс-тинкции для перекиси водорода б = 39.4 (М см)-1 по методу [13].
ей
| §40 к °
35
ОрД 35 ^ О
Э ^
£ н 30 й о
§* 25
Ей
20
§ Л О
5 « 15
Р
р
V о
д
а к о ¡=т
10
X
и
4.5 11.3 22.5
Концентрация, мкМ
45.0
Рис. 1. Антирадикальная активность фуростаноловых гликозидов (ФГ) и аскорбиновой кислоты (АК) в отношении анион-радикала кислорода в бесклеточной системе. 1 - ФГ, 2 - АК.
Активность аскорбатпероксидазы определяли по уменьшению оптической плотности при 298 нм в результате окисления аскорбиновой кислоты перекисью водорода (г = 0.80 (М см)-1) по методу [14]. Для каждого определения проводили также контрольное измерение неспецифического окисления аскорбата. Активность фермента выражали в ммоль окисленного аскорбата/(г сырой массы мин).
Суммарную активность СОД определяли с использованием нитро-синего тетразолия, конкурирующего с СОД за супероксидные анионы, образующиеся в результате взаимодействия метио-нина и рибофлавина при освещении в течение 30 мин и температуре 25°С по методу [15]. Оптическую плотность измеряли при 560 нм; активность фермента выражали в
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.