ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2014, том 456, № 4, с. 494-498
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.15
СТИМУЛИРУЮЩЕЕ ВЛИЯНИЕ ТИЕНОПИРИМИДИНОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ НА АДЕНИЛАТЦИКЛАЗНУЮ СИГНАЛЬНУЮ СИСТЕМУ В СЕМЕННИКАХ КРЫС © 2014 г. А. О. Шпаков, Д. В. Дарьин, К. В. Деркач, П. С. Лобанов
Представлено академиком Н.П. Веселкиным 23.09.2013 г. Поступило 20.01.2014 г.
БО1: 10.7868/80869565214160300
Среди сопряженных с гетеротримерными О-белками рецепторов серпантинного типа (ОРСЯ) выделяется группа рецепторов гипофизарных гликопротеиновых гормонов — лютеинизирую-щего (ЛГ), фолликулостимулирующего и тирео-тропного, характерной особенностью которых является наличие значительного по размеру внеклеточного домена с расположенным в нем ли-гандсвязывающим сайтом [1, 2]. При связывании с ним молекулы гормона запускается каскад кон-формационных перестроек, который вызывает изменение структуры трансмембранного канала рецептора, сформированного семью спиральными трансмембранными участками, что, в свою очередь, приводит к продуктивному взаимодействию цитоплазматических доменов рецептора с О-белками и обеспечивает передачу гормонального сигнала с рецептора к внутриклеточным эф-фекторным белкам. Однако практическое применение гликопротеиновых гормонов в медицине сопряжено с целым рядом проблем, среди которых — их низкая устойчивость к протеолитической деградации, высокая иммуногенность, развитие резистентности к ним тканей-мишеней, необходимость парентерального введения. Вследствие этого в последние годы проводится поиск низкомолекулярных агонистов рецепторов гликопротеино-вых гормонов, способных проникать в трансмембранный канал, где в большинстве ОРСЯ расположен лигандсвязывающий сайт, и вызывать в нем те же структурные изменения, которые происходят при связывании гликопротеинового гормона с внеклеточным доменом рецептора [3, 4].
Все вышесказанное в полной мере относится к рецептору ЛГ, эндогенными лигандами которого
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова
Российской Академии наук, Санкт-Петербург Санкт-Петербургский государственный университет
являются ЛГ и хорионический гонадотропин человека (ХГЧ). Рецепторы ЛГ в мужском организме локализованы преимущественно в тестику-лярных клетках и вовлечены в контроль андроге-неза и сперматогенеза. Нарушение их функции приводит к бесплодию и задержке полового созревания. Вследствие этого разработка селективных и эффективных регуляторов рецептора Л Г является одной из актуальных задач современной фармакологии и молекулярной эндокринологии.
В последние годы было открыто несколько классов низкомолекулярных агонистов рецептора Л Г, среди которых наиболее активным было соединение Ог§41841, М-трет-бутил-5-амино-4-(3-метоксифенил)-2-(метилтио)тиено[2,3-^]пи-римидин-6-карбоксамид и его аналог Ог§43553, относящиеся к классу тиенопиримидинов. Они, действуя в наномолярных концентрациях, активировали рецептор ЛГ и зависимые от него сигнальные каскады. Стимулирующий эффект Ог§43553 по величине был сопоставимым с таковым ЛГ и характеризовался высокой специфичностью по отношению к рецептору ЛГ [5, 6].
Цель работы состояла в изучении влияния впервые синтезированных аналогов Ог§43553, 5-амино-М-(трет-бутил)-4-(3-(изоникотинамидо)феннл)-2-(метилтио)тиено[2,3-^]пиримидин-6-карбокса-мида (вещество 1) и 5-амино-М-(трет-бутил)-2-(метилтио)-4-(3-(тиофен-3-карбоксамидо)фе-нил)тиено[2,3-^| пиримидин-б-карбоксамида (вещество 2) (рис. 1) на функциональную активность чувствительной к ЛГ аденилатциклазной сигнальной системы (АЦСС) в семенниках крыс. Выбор АЦСС в качестве объекта исследования был продиктован тем, что она является основной мишенью действия ЛГ и тиенопиримидинов [7] и опосредует наиболее важные биологические эффекты ЛГ, включая регуляцию синтеза и секреции тестостерона клетками Лейдига.
Для синтеза тиенопиримидиновых производных 1 и 2 проводили реакцию 5-амино-4-(3-ами-
1 2
N
л
MeS N
NH2
,NH
NH2
\
S
"A
о
NH
о II
R CI
N
1
MeS N
NH2 \
S
"A
о
Nh
5-Амино-4-(3-аминофенил)-^(трет-бутил)-2-(метилтио)тиено[2,3-^]пиримидин-6-карбоксамид
1, 2
Рис. 1. Структура тиенопиримидиновых производных и схема их получения из 5-амино-4-(3-аминофенил)-К-(трет-бутил)-2-(метилтио)тиено[2,3-йГ]пиримидин-6-карбоксамида. Я = 4-пиридил (вещество 1) или 3-тиенил (вещество 2).
нофенил)-М-(трет -бутил)-2-(метилтио)тие-но[2,3-^]пиримидин-6-карбоксамида, который получали по методу [8], с изоникотиноилхлори-дом и тиофен-3-карбонилхлоридом соответственно (рис. 1). Целевой продукт выделяли с помощью колоночной хроматографии в системе этилацетат—гексан 3 : 1 с выходом 56% для вещества 1 и 28% — для вещества 2. Полученные соединения характеризовали по температуре плавления, спектру ЯМР 1Н и с помощью масс-спектрометрии высокого разрешения. Вещество 1 (С^Н^^О^): т. пл. 154—157°С; спектр ЯМР 1Н ^С13), 8, м. д. (I, Гц): 1.45 (9Н, с); 2.66 (3Н, с); 5.30 (1Н, с); 5.96 (2Н, с); 7.37 (1Н, д, I = 7.8); 7.54 (1Н, т, I = 7.8); 7.70 (1Н, с); 7.77 (2Н, д, I = 5.6); 8.06 (1Н, д, I = 7.8); 8.65 (1Н, с); 8.79 (2Н, д, I = 5.6); по данным HRMS (ESI-T0F) молекулярная масса вещества 1 составила 493.1477 Да (вычислено для [М + Н+] — 493.1475). Вещество 2 (С23Н23М50^3): т. пл. 146-148°С, спектр ЯМР 1Н ^С13), 8, м. д. (I, Гц): 1.46 (9Н, с); 2.67 (3Н, с); 5.29 (1Н, с); 5.99 (2Н, с); 7.33 (1Н, д, I = 7.8); 7.39 (1Н, д.д, I = 3.0 и 5.0); 7.51 (1Н, т, I = 7.8); 7.56 (1Н, д, I = 5.0); 7.66 (1Н, с); 8.04 (1Н, д, I = 7.8); 8.08 (1Н, д, I = 3.0); 8.20 (1Н, с); по данным HRMS (ESI-T0F) молекулярная
масса вещества 2 составила 498.1065 Да (вычислено для [M + Н+] - 498.1087).
В биохимических экспериментах использовали ХГЧ, креатинфосфат, креатинфосфокиназу из мыши кролика (НФ 2.7.3.2), АТФ, ГТФ, Р,у-имидо-гуанозин-5'-трифосфат (GppNHp) и другие реактивы фирм "Sigma" (США). Для определения активности АЦ использовали [а-32Р]АТФ (1000 Ки/ммоль) (ОАО Институт реакторных материалов, Россия), для определения ГТФ-связывания — [8-3H]Gpp-NHp (5 Ки/ммоль) ("Amersham", Англия). Определение активности АЦ (АТФ-пирофосфатлиаза циклизующая, НФ 4.6.1.1) и ГТФ-связывания ге-теротримерных G-белков проводили, как описано ранее [9, 10]. Активность АЦ выражали в пмоль цАМФ за 1 мин на 1 мг мембранного белка, ГТФ-связывание — в пмоль [8-3H]GppNHp на 1 мг мембранного белка. Тиенопиримидиновые производные растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО), затем в соответствующих разведениях преинкубировали с фракциями тестикулярных мембран при 4°C в течение 10 мин, после чего добавлением инкубационной смеси начинали ферментативную реакцию образования цАМФ, катализируемую АЦ, или реакцию ГТФ-связывания
Активность АЦ, пмоль цАМФ/мин на мг белка 80
60
40
20
(а)
И
8
7
6
5
ГТФ-связывание, пмоль [8-3Н]ОррКНр на мг белка 1.8
(б)
1.6
1.4
1.2
1.0
4
3
-^[агонист], М
Рис. 2. Стимулирующий эффект тиенопиримидино-вых производных на базальную активность АЦ (а) и уровень ГТФ-связывания (б) в тестикулярных мембранах крыс; М± т, п = 8.
О-белков. Контрольные пробы преинкубировали с ДМСО в соответствующем разведении. При определении активности АЦ реакцию проводили в течение 12 мин при 37°С, при определении ГТФ-связывания — в течение 40 мин при 30°С.
Для исследования были взяты крысы-самцы, популяции Wistar возрастом 5—6 мес. Животных декапитировали в условиях анестезии и удаляли у них семенники. Выделение тестикулярных мем-
Стимулирующий эффект, % 160
140
120
100
80
60
40
20
0
□ 1 □ 2 I—13
Активность АЦ ГТФ-связывание
Рис. 3. Влияние преинкубации тестикулярных мембран с тиенопиримидиновыми производными на вызываемую ХГЧ стимуляцию активности АЦ и ГТФ-связывания. 1 — ХГЧ, 10-8 М; 2 — ХГЧ + вещество 1, 10-4 М; 3 - ХГЧ + вещество 2, 10-4 М; М± т, п = 8.
бран из семенников проводили следующим образом [11]. Измельченную ткань семенников гомогенизировали в 40 мМ трис-НС1-буфере (рН 7.5), который содержал 5 мМ MgC12, 10% ^/у) сахарозу и коктейль ингибиторов протеаз. Гомогенат центрифугировали при 1500 g в течение 10 мин, после чего супернатант центрифугировали при 20000 g в течение 30 мин. Полученный осадок ре-суспендировали в буфере без сахарозы и повторно центрифугировали в том же режиме. Фракции плазматических мембран из миокарда и тканей мозга (коры больших полушарий, стриатума и гиппокампа) крыс выделяли, как описано ранее [9, 12].
Статистический анализ данных проводили с помощью метода АМОУА, каждый эксперимент был выполнен трехкратно. Данные нескольких независимых экспериментов представлены в виде М± т. Различия между активностью АЦ и уровнем ГТФ-связывания в контроле и в пробах, обработанных тиенопиримидиновыми производными и ХГЧ, оценивали как достоверные прир < 0.05.
Базальная активность АЦ в тестикулярных мембранах крыс составила 23.2 ± 1.9 пмоль цАМФ/мин на 1 мг мембранного белка. Оба тиенопиримиди-новых производных (10-7-10-3 М) дозозависимо стимулировали активность фермента (рис. 2а). Значения ЕС50 для АЦ-стимулирующих эффектов веществ 1 и 2 составили 1.12 мкМ и 280 нМ соответственно . Максимальный стимулирующий АЦ-эффект вещества 2 превосходил таковой вещества 1 на 58%. О более высокой эффективности вещества 2 свидетельствует тот факт, что значение
0
4
3
6
7
5
ЛиС10-у_10-э (площадь под кривой) для его АЦ-эф-фекта было на 83% выше значения ЛиС10-7 3 для вещества 1.
Оба вещества повышали уровень специфического связывания [8-3Н]ОррМНр с тестикулярны-ми мембранами, который в их отсутствие составил 1.22 ± 0.07 пмоль [8-3Н]ОррМНр на 1 мг мембранного белка. Как и в случае активации АЦ, максимальный стимулирующий эффект вещества 2 на ОррМНр-связывание и значение ЛиС10_у _10-5 были выше, чем для вещества 1 (рис. 2б). Значения ЕС50 для стимуляции тиенопиримидиновыми аналогами ГТФ-связывания составили 1.93 мкМ и 630 нМ и были близки таковым для АЦ-эффекта.
Тиенопиримидиновые производные не влияли на активность АЦ и ГТФ-связывающую способность О8-белков в плазматических мембранах, выделенных из миокарда и мозга крыс, где рецепторы ЛГ отсутствуют или экспрессируются в незначительной степени (данные не представлены). Следоват
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.