ОНТОГЕНЕЗ, 2011, том 42, № 5, с. 357-362
= БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ РАСТЕНИЙ
УДК 581
СТИМУЛЯЦИЯ ДЕЛЕНИЙ КЛЕТОК ПОКОЯЩЕГОСЯ ЦЕНТРА В ОТРЕЗАННЫХ КОНЧИКАХ КОРНЕЙ
© 2011 г. В. Б. Иванов, Е. И. Быстрова, М. М. Месенко, Л. М. Котова, А. А. Котов
Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН 117276, Москва, ул. Ботаническая, д. 33 E-mail: ivanov_vb@mail.ru Поступила в редакцию 13.12.2010 г. Окончательный вариант получен 11.02.2011 г.
В статье описана активация делений клеток покоящегося центра в отрезанных кончиках корней, выдерживаемых на влажной фильтровальной бумаге в чашках Петри. Это явление наблюдалось у корней 8 из 14 изученных сортов кукурузы и не наблюдалось в отрезках корней арабидопсиса. Характер распределения делений в меристеме существенно варьирует в корнях разных проростков в одной и той же партии проростков и в корнях проростков разных сортов кукурузы. Открывание меристемы наблюдалось при отрезании как маленьких кусочков корней (до 3 мм), так и целых корней. ИУК (10-6—10-8 М) и сахароза (2%) не предотвращали открывание меристемы. Полученные данные показывают, что покоящееся состояние клеток покоящегося центра поддерживается системой межклеточных и межорганных взаимодействий.
Ключевые слова: корень, меристема, покоящийся центр, стволовые клетки.
Растущая часть корня состоит из меристемы, где сосредоточены деления клеток, и зоны растяжения, где они за счет быстрого роста достигают окончательной длины. Небольшая апикальная группа клеток меристемы резко отличается от остальных клеток. Они делятся примерно в 8— 10 раз реже большинства клеток, слабо базофиль-ны, у них мелкие ядрышки, замедлены синтезы белков и РНК. По этим признакам эта группа клеток была названа Clowes (1956) "покоящимся центром". Он найден во всех корнях, за исключением корней с очень коротким периодом роста, например, некоторых кактусов (Rodriguez-Rodrigues et al., 2003). Изучению покоящегося центра посвящена большая литература, которую невозможно даже кратко рассмотреть в рамках этой статьи. Однако до сих пор неясно, какое функциональное значение имеют клетки покоящегося центра и какие механизмы определяют его образование на ранних стадиях развития корня и дальнейшее поддержание.
Одним из подходов к решению этой проблемы является анализ изменения клеток покоящегося центра и окружающих его клеток при разных воздействиях. Clowes (1963) показал, что после радиоактивного облучения корней в не слишком высоких дозах клетки покоящегося центра начинают активно делиться, тогда как деления большинства в норме активно делящихся клеток меристемы блокируются. Деления клеток покояще-
гося центра приводят к восстановлению меристемы и возобновлению нормального роста корня. Аналогичное явление наблюдалось после выдерживания корней проростков кукурузы при низких положительных температурах (Clowes, Stewart, 1967; Barlow, Rathfelder, 1985). После переноса корней в нормальные условия деления клеток покоящегося центра активизировались, а деления большинства меристематических клеток тормозились. В наших опытах (Нестерова, 1989; Кожевникова и др., 2007) мы наблюдали активацию делений клеток покоящегося центра при выдерживании корней на растворах ряда токсикантов, например Pb(NO3)2, которая приводила к образованию нового чехлика взамен слущегося после погружения корней в раствор токсиканта.
В ходе роста корней в нормальных условиях или при повышенной температуре также описаны случаи активации делений клеток покоящегося центра, что приводило к изменению структуры меристемы из закрытой в открытую (Clowes, Wadekar, 1989). Эти два типа меристемы отличаются наличием общих или отдельных инициальных клеток у разных тканей. Тип меристемы является одним из систематических признаков (He-imsch, Seago, 2008).
В этой статье описывается активация делений клеток покоящегося центра в отрезанных кончиках главных корней проростков ряда сортов кукурузы, помещенных в разные условия.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Работа проводилась с проростками кукурузы и арабидопсиса. Были изучены 13 сортов и гибридов кукурузы: Интеркрас-375, полученный из ГНУ Краснодарский НИИСХ Россельхозакаде-мии, и Харьковский-295 МВ, Кабардино-балкарская 38/12, Институтская, Сахарная белая К9615 и К23265, Сахарная желтая К20589 и К10828, Зубовидная белая К451 и К21518, Зубовидная желтая К18968 и 23215, Б272, Аргентина КОС, полученными из ВИР им. Н.И. Вавилова (номера указаны по коллекции ВИР). Семена трансгенных растений Arabidopsis thaliana были получены от профессора Ben Scheres (Утрехтский университет, Голландия). Они содержали химерный ген, в котором промотор гена WOX-5 слит с репортер-ным геном GFP. Ген WOX-5 экспрессируется в клетках покоящегося центра и является одним из генов, активность которого необходима для формирования и поддержания покоящегося центра (Sarkar etal., 2007). В использованной конструкции экспрессия этого гена определялась по флуоресценции белка GFP, что позволяло выявлять места экспрессии гена WOX-5, которая наблюдается только в клетках покоящегося центра. Таким образом, по распределению флуоресценции можно выявить изменение размеров покоящегося центра и числа клеток, входящих в его состав.
Семена кукурузы стерилизовали 1% формалином в течение 20 минут и проращивали в кюветах на влажной фильтровальной бумаге в термостате при 27°С. У 2-3-дневных проростков отрезали в большинстве опытов 1-см кончики корней; в ряде опытов — целые корни или кончики длиной 5 и 3 миллиметра. Отрезанные кончики помещали на фильтровальную бумагу, смоченную дистиллированной водой или растворами разных соединений в дистиллированной воде. Через 24 часа кончики корней фиксировали по Бродскому (формалин-96% спирт—ледяная уксусная кислота: 10 : 3 : 1).
Фиксированные корни заключали в парафин по общепринятой методике. Срезы толщиной 10 микрон окрашивали двумя методами: 1) ШИК реакция с последующим подкрашиванием срезов 0.15% раствором проционового яркоголубого 4RS в 0.2% растворе Na2CO3 в течение 40 минут при комнатной температуре, 2) ШИК реакция, затем реакция Фельгена с последующим подкрашиванием 0.1% раствором алцианового синего 8GS в 3% уксусной кислоте в течение 30 минут при комнатной температуре.
Проростки арабидопсиса выращивали в конструкции типа "сэндвич" с предварительной стерилизацией семян смесью перекиси водорода и этилового спирта (1 : 1), стратификацией 72 ч при 4°С и с последующим проращиванием в течение 7 дней в фитотроне при +22°С с освещением 1015 тыс. лк и режимом день/ночь: 16/8 часов.
У корней семидневных проростков отрезали 5-мм кончики, которые помещали в чашки Петри на фильтровальную бумагу, смоченную дистиллированной водой на 24 часа. Затем корни фиксировали свежеприготовленным 4% формалином с последующей проводкой через 5 растворов с возрастающей концентрацией глицерина по 5 минут до 50% глицерина, а затем просветлялись по методу Malamy и Benfey (1997). Корни просматривали на флуоресцентном микроскопе Olympus CX41. Совмещение нескольких фотографий разных оптических срезов для получения большей глубины резкости производили с помощью программы HeliconFocus 3.10 или на конфокальном микроскопе Leica TSC SPE (Германия) при длине волны 405 нм.
Все опыты были повторены не менее двух раз. В таблице указано число центральных срезов корней, на которых обсуждаемое явление отчетливо может быть установлено.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Отрезанные кончики корней, помещенные в чашки Петри на влажную фильтровальную бумагу, практически прекращают рост. Их длина возрастала за 24 часа не более, чем на 2—3 мм, тогда как контрольные корни в этих условиях удлинялись на 3—40 мм. Однако в отрезанных корнях не прекращалась закладка боковых корней, примор-дии которых были видны уже на расстоянии 4— 5 мм от кончика корня. В нормальных корнях они находятся гораздо дальше (Дубровский, Иванов, 1984). Это приближение закладок боковых корней к кончику корня обусловлено прекращением роста и наблюдалось у всех сортов. Деления клеток в основной части меристемы и в чехлике практически прекращались. В отрезанных корнях проростков сорта Интеркрас-375 делений не было уже через 12 ч. В отрезанных целиком корнях деления клеток не прекращались после 24 ч, но число их было меньше, чем в контрольных корнях.
Однако уже в первых опытах с отрезанными кончиками корней проростков кукурузы гибрида Интеркрас-375 длиной 1 см наблюдались деления клеток покоящегося центра, и в особенности самого внешнего слоя клеток, с образованием выростов, состоящих из большого числа клеток в сторону чехлика (рис. 1). У некоторых корней открывание меристемы и образование таких "выростов" в сторону чехлика наблюдалось уже через 12 ч. Степень выраженности пролиферации клеток покоящегося центра сильно варьировала в разных корнях. Аналогичное явление наблюдалось в отрезках как меньшей длины (3 и 5 мм), так и в целых корнях длиной 10—12 см, отрезанных около семени. Подобное открывание меристемы и заметное образование протуберанцев клеток из покоящегося центра в сторону чехлика не наблю-
СТИМУЛЯЦИЯ ДЕЛЕНИИ КЛЕТОК ПОКОЯЩЕГОСЯ ЦЕНТРА
359
Перестройка меристемы из закрытой в открытую через 24 часа после изоляции корней (в скобках указано число корней с открытой меристемой от общего числа корней)
Сорт кукурузы
Меристема открыта
Практически у всех корней
Не у всех корней
Активация делений многих клеток покоящегося центра (образование "выростов" в сторону чехлика)
Активация делений единичных клеток покоящегося центра
Меристема
закрыта практически у всех корней
Интеркрас-375 Харьковский 295МВ Сахарная белая К9615 Зубовидная белая К21518 Зубовидная желтая К18968 Сахарная белая К23265 Зубовидная белая К451 Институтская
Кабардино-балкарская 38/12 Сахарная желтая К10828 Зубовидная желтая 23215.Б272 Аргентина КОС
+(18 из 18)
+(6 из 13) +(7 из 13) +(8 из 10)
+(8 из 12) +(4 из 5) +(11 из 16)
+(19 из 21) +(24 из 26) +(5 из 5) +(7 из 7) +(11 из 11)
далось нами у интактных корней. Чтобы проверить, происходит ли такое открывание меристемы у отрезанных кончиков корней проростков других сортов кукурузы, мы изучили корни проростков 12 сортов. Полученны
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.