БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 3, с. 348 - 357
УДК 577.322.5
СТРАТИФИКАЦИЯ ЦЕНТРОВ ПРИСОЕДИНЕНИЯ ХОНДРОИТИНСУЛЬФАТА К ФЕРМЕНТУ НА 3D-МОДЕЛИ БЫЧЬЕЙ ТЕСТИКУЛЯРНОЙ ГИАЛУРОНИДАЗЫ И ЭФФЕКТИВНЫЙ РАЗМЕР ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВОЙ ОБОЛОЧКИ МОДИФИЦИРОВАННОГО БЕЛКА
© 2015 А.В. Максименко*, А.Д. Турашев, Р.Ш. Бибилашвили
Институт экспериментальной кардиологии, Российский кардиологический научно-производственный комплекс Минздрава России, 121552 Москва, 3-я Черепковская ул., 15а; факс: +7(495)414-6699, электронная почта: alexmak@cardio.ru
Поступила в редакцию 21.02.14 После доработки 29.09.14
Используя в качестве прототипа установленную пространственную структуру гиалуронидазы человека, была построена т зШсо методом молекулярного гомологичного моделирования ЗО-структура бычьей тестику-лярной гиалуронидазы (БТГ). Ее анализ обнаружил наличие стратификации остатков лизина при модификации фермента. Моделируя ковалентное связывание с ними активированных бензохиноном звеньев хонд-роитинсульфата (ХС), была получена ЗО-структура модифицированной ХС БТГ (БТГ—ХС). При этом варьировалась как степень модификации фермента, так и размер ковалентно присоединенных к нему цепей ХС. Показана значимость глубоких степеней модификации БТГ для получения активных и стабильных ферментных производных, установленная ранее экспериментально. Подтвержден эффективный размер ХС-оболоч-ки для продуктивной модификации БТГ. Теоретически он достигается при увеличении молекулярной массы производного БТГ—ХС до 140—180 кДа и может быть практически получен, согласно экспериментальным данным, с использованием ХС разной молекулярной массы (как 30—50, так и 120—140 кДа).
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: бычья тестикулярная гиалуронидаза, пространственная структура, хондроитинсуль-фат, модификация остатков лизина, конъюгат гиалуронидаза—хондроитинсульфат, степень модификации, хондроитинсульфатная оболочка.
Взаимосвязь структуры и функции макромолекул предстает одной из тематических детерминант биохимии. Актуальность этого направления увеличилась благодаря стремительному формированию биотехнологии, биоинженерии, биофармакологии. Реально ощутимы результаты практического использования ферментных производных в медицинской области, в частности в кардиологии, онкологии, гастроэнтерологии [1, 2]. Исследовательский интерес стал еще выше с развитием гликобиологии [3]. Так,
Принятые сокращения: 3D — пространственная/ /трехмерная/третичная структура белка; БТГ — бычья тестикулярная гиалуронидаза; ТНБС — тринитробензосуль-фоновая кислота; ХС — хондроитинсульфат; GCU — глю-куроновая кислота; NAG — N-ацетилглюкозамин; RMS — величина среднеквадратичного отклонения Са-атомов модели от положения Са-атомов прототипа; ЭФР — эпидер-мальный фактор роста; а.о. — аминокислотные остатки.
* Адресат для корреспонденции.
первой стадией повреждения сосудистой стенки, обусловливающей развитие сердечно-сосудистых патологий, выступает в большинстве случаев нарушение целостности эндотелиаль-ного гликокаликса [4]. В организме регуляторами его состояния помимо биосинтеза de novo предстают активные формы кислорода, протео-литические и гликозидазные ферменты [5, 6]. Последние определяют in vivo катаболизм гли-козаминогликановой части эндотелиального гликокаликса и экстрацеллюлярного матрикса. Среди ферментов гликозидазной группы можно выделить гиалуронидазы [7], ответственные за метаболизм гиалуронана — одного из основных компонентов эндотелиального гликокаликса (лимитирующего его проницаемость [8, 9]) и важного структурного элемента раковых опухолей [10, 11]. Бычья тестикулярная гиалуронидаза (БТГ, EC 3.2.1.35) является коммерчески доступным медицинским препаратом, разрешенным в России для внутримышечных/подкож-
ных инъекций и местного применения, и становится значимым объектом гликобиологических исследований [12]. Стремительность их развития продемонстрировала как внятные успехи этого направления, так и затруднения его роста. Исследовательские трудности связаны с малой изученностью гиалуронидаз позвоночных, их невысокой, а то и крайне низкой концентрацией в организме (~60 нг/мл) и заметным недостатком структурной информации [13]. Вместе с тем современное развитие приемов вычислительной химии in silico, появление кристаллических структур гиалуронидазы пчел [14] и человека [15] способствует преодолению отмеченных затруднений. Кроме того, гиалуронидазы позвоночных, проявляя на порядок более высокую ферментативную активность, чем другие глобулярные биокатализаторы, обнаруживают невысокую стабильность при очистке и выделении [12, 13]. Такое положение четко обосновывает значимость обеспечения доступности этих ферментов для исследовательских целей и разработки на их основе новых стабилизированных производных биокатализаторов. Актуальность получения модифицированных форм гиалуро-нидазы со стабильной эндогликозидазной активностью для медицинского применения [16, 17], естественно, ассоциируется с важностью изучения молекулярной структуры таких производных для оптимизации их свойств.
Целью нашей работы стало построение трехмерной структуры нативной (БТГ) и модифицированной ХС гиалуронидазы (БТГ—ХС) методами компьютерного моделирования, выявление иерархии s-аминогрупп остатков лизина при модификации фермента ХС и определение эффективных размеров гликозаминогликановой оболочки модифицированного биокатализатора. Теоретически полученные данные были сопоставлены с ранее полученными результатами экспериментального изучения.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Моделирование 3Б-структуры БТГ (NP_001-008413.2 sperm adhesion molecule) продукта гена SPAM1 (sperm adhesion molecule 1 [Bos taurus], (РН20, HyalP)) было начато в 2008 г. и осуществлено с использованием трех разных алгоритмов на основе гомологичного моделирования. Использованы три сервера: Лондонского имперского колледжа (Phyre), Лионского центра биоинформатики (Geno3D), Швейцарского центра биоинформатики (Базель) и программа Modeller [18, 19].
Последовательность аминокислот построена по последовательности нуклеотидов структуры
основного варианта мРНК гена SPAM1 (Bos taurus) без учета возможных посттрансляционных модификаций. Зрелый белок согласно литературным данным соответствует последовательности между 36 и 490 аминокислотами. Выравнивание структуры со всеми гомологичными структурами осуществлялось с использованием алгоритма CLUSTRALx различными программами в зависимости от использованного сервера. При локальном моделировании использовали пакет «Chimera».
Всего было получено шесть структур, пять похожих друг на друга с RMS менее 12 А, которые были подвергнуты процедуре оптимизации структуры с использованием силовых полей Amber96, CharMM и Gromos96. Оптимизация всех структур проводилась в условиях вакуума при диэлектрической константе изотропной среды внутри молекулы, равной 4, вовне молекулы — 80 и ионной силе среды 0,1 М. Все остатки лизина и гистидина, экспонированные в растворитель, рассматривались в протонированной форме, а неэкспонированные на поверхность — в незаряженной форме. Результирующие структуры, полученные из всех пяти моделей, были практически одинаковы — RMS менее 2 А.
Оценка качества произведенного моделирования проведена с использованием алгоритмов и серверов: Procheck [20—22] и WhatCheck/ /WhatIf Gert Vriend's protein structure analysis & verification tools [23—26]. Полученная структура была проанализирована с помощью программ WhatIf и Procheck. «Надежность» полученной структуры — не ниже, чем качество использованного прототипа. Дополнительная оптимизация нескольких аминокислотных остатков (Asp 37, Phe 38, Lys 160, Asp 385, Glu 257, Thr 422) вполне возможна. Из рассмотрения был исключен С-концевой домен, следующий за доменом, сходным с эпидермальным фактором роста (EGF like), из-за отсутствия в базе данных 30-структур, гомологичных С-концевому домену БТГ.
Построение 30-модели структуры БТГ, модифицированной ХС, проводилось с использованием 30-модели БТГ, полученной нами на основании гомологии с гиалуронидазой человека, пространственная структура которой известна [15]. Моделирование химической модификации БТГ активированным бензохиноном ХС [17] опиралось на исходные экспериментальные данные. Они свидетельствовали, что для модификации БТГ использовали ХС с молекулярной массой 120-140 [17] или 30-50 кДа [27, 28] с неизвестным распределением молекулярных масс. В результате модификации БТГ молекулярная масса модифицированного фермента возрастала
до 180 кДа, а степень модификации алифатических аминогрупп составляла 82—88% (т.е. такая их доля от исходной была блокирована или маскирована для титрования тринитробензосуль-фоновой кислотой, ТНБС). Производное БТГ—ХС сохраняет 76—78% (при рН 5,5) и 63—65% (при рН 7,5) первоначальной эндогликозидазной активности [17] и изменяет отклик на взаимодействие с моно-, дисахаридами и короткими фрагментами гликозаминогликанов [27].
Построение ЗБ-модели БТГ—ХС вели поэтапно. Первоначально достигали постепенного экранирования поверхностных остатков лизина (сначала 2, потом 6, затем 12, 19, 21 соответственно) БТГ тетрамерами (октасахаридами) ХС. Затем эти электростатически связанные с белком фрагменты ХС статистически заполиме-ризовывали в цепочки ХС, учитывая, что 60 ди-сахаридных звеньев ориентировочно составляют полимер с массой 30 кДа. Заряды всех суль-фогрупп нейтрализовали гидратированным катионом (Н20)5. Так получали 3Б-структуру нековалентного электростатического комплекса БТГ..ХС. Похожим образом строили и 3Б-структуру ковалентного производного БТГ—ХС. После электростатического присоединения фрагментов ХС по е-аминогруппам поверхностных остатков лизина БТГ моделировали их ко-валентное связывание посредством бензохино-новой активации, а затем осуществляли статистическую полимеризацию ковалентно присоединенных фрагментов ХС в его цепь. Качество построенных 3Б-моделей нековалентного и ковалентного производного БТГ—ХС проверялось тем же набором программ, что и полученная на-
ми ранее 30-структура БТГ. Обнаружены отклонения от стандартных углов и длин связей вблизи контактных остатков лизина. Искажения 30-структуры БТГ в э
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.