ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2014, том 61, № 2, с. 275-282
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1:581.575
СТРЕСС-ПРОТЕКТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ КОМПЛЕКСА ФЕНИЛПРОПАНОИДОВ НА РАСТЕНИЯ КАРТОФЕЛЯ IN VITRO © 2014 г. Л. А. Волкова, В. В. Урманцева, А. Б. Бургутин
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва Поступила в редакцию 25.12.2012 г.
Исследовано влияние комплекса фенилпропаноидов (КФП), выделенного из экстракта корней ро-диолы розовой (Rhodiola rosea L.), на растения картофеля (Solanum tuberosum L.) in vitro с целью идентификации факторов, обуславливающих поддержание внутриклеточного редокс-гомеостаза. Обнаружено, что обработка растений КФП в концентрации 100 мкМ приводила к снижению на 23% пе-роксидазной активности в клетках растений картофеля, а также к обратимому увеличению уровня перекисного окисления липидов (ПОЛ) в условиях окислительного стресса, вызванного действием параквата. В присутствии НАД-Н, известного оксидазного субстрата пероксидаз (ПО), показано, что снижение пероксидазной активности связано с "переключением" пероксидазы на выполнение этим ферментом оксидазной функции. Этот эффект сопровождался увеличением активности су-пероксиддисмутазы на 34% и повышением уровня ПОЛ — также на 34%. Стимуляция этих процессов под действием КФП снижалась на 14 и 24%, соответственно, после предварительной обработки растений дифенилен иодониумом, ингибитором НАДФ-Н-оксидазы. Это может указывать на участие "тандема" ПО—НАДФ-Н-оксидаза в генерации активных форм кислорода. Наряду со снижением пероксидазной реакции ПО, наблюдался и обратный эффект — усиление ее активности через 3 ч после действия КФП, что связано со способностью КФП переключать функции пероксидаз с окислительной на восстановительную и обратно. Установлено, что наблюдаемые эффекты КФП включают в себя не только соответствующую модуляцию активности антиоксидантных ферментов, но и прямое тушение активных радикалов кислорода. Последний эффект, выявленный по интенсивности снижения в препаратах уровня супероксид-аниона, у КФП значительно превосходил действие индивидуальных антиоксидантов — салидрозида и аскорбиновой кислоты, ингибирующая активность которых была в 5 раз меньше таковой КФП.
Ключевые слова: Rhodiola rosea — Solanum tuberosum — in vitro — фенилпропаноиды — антирадикальные свойства — окислительный стресс
DOI: 10.7868/S0015330314010163
ВВЕДЕНИЕ
В течение последнего десятилетия наблюдается рост числа публикаций, посвященных исследованию антиоксидантных свойств различных классов соединений. Значительную часть из них представляют соединения фенольного комплекса, обладающие высокой окислительно-восстановительной активностью. Антиоксидантные свойства фенолов связаны с наличием в их структуре слабых фенольных гидроксильных групп, которые легко отдают атом водорода при взаимо-
Сокращения: КФП — комплекс фенилпропаноидов; ПО — пероксидаза; СОД — супероксиддисмутаза: ТБК-АП — комплекс тиобарбитуровой кислоты и взаимодействующих с ней активных продуктов.
Адрес для корреспонденции: Волкова Людмила Александровна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН. Электронная почта: la-volkova@yandex.ru
действии со свободными радикалами [1], что способствует ингибированию процессов радикально-цепного окисления в организме, защищая таким образом биомолекулы (липидные мембраны, белки, ДНК) от окисления. Однако наряду с ан-тиоксидантным действием фенольным соединениям свойственно проявление в определенных условиях прооксидантных свойств [2].
Среди фенольных соединений с высокой окислительно-восстановительной активностью, значительное место занимают фенилпропаноиды родиолы розовой. Основными действующими веществами этого растения являются гликозиды коричного спирта (розавин, розин, розарин) и салид-розид, из группы простых фенольных соединений [3]. При неблагоприятных условиях происходит активация фенилпропаноидного метаболизма, что приводит к формированию устойчивости расте-
ний к действию стрессовых факторов [4]. В борьбе со свободными радикалами принимают участие не только антиоксидантные вещества, вырабатываемые растительными клетками, но и антиоксиданты, поступающие в клетки при их экзогенном воздействии [5]. Препараты на основе растительного сырья, содержащего фенилпро-паноиды, которые давно и успешно применяются в медицинской практике [6], требуют дополнительного изучения их действия и на растительные объекты. К настоящему времени известны лишь немногочисленные доказательства защитного действия фенольных соединений (в основном флавоноидов) при их экзогенном воздействии на растения [7—9].
Фенольные соединения способны не только непосредственно ингибировать протекание свободно-радикальных процессов в клетке, но и участвовать в обезвреживании Н2О2 и органических пероксидов при окислении фенол-зависимыми пероксидазами. В защите растительных клеток от окислительного стресса важную роль играет гваяколовая пероксидаза (ПО). Этот фермент привлекает особое внимание, поскольку обладает высоким сродством к Н2О2, которая активно продуцируется при окислительном стрессе [10, 11]. Однако функции ПО не ограничиваются только детоксикацией перекисей; наряду с деток-сикацией, фермент участвует также и в их образовании. Как свидетельствуют данные литературы, при окислении полифенолов некоторые апо-пластные ПО проявляют свою оксидазную — про-оксидантную функцию, что способствует образованию O2-, Н2О2 и радикалов органического субстрата при физиологическом значении рН [8]. Существенный вклад в генерацию АФК может вносить и НАДФ-Н-оксидаза. В процессе каталитической реакции фермент способен генерировать свободные радикалы — O^, ОН* и радикалы органического субстрата [12, 13]. Считается, что основной пул НАДФ-Н-оксидазы у растений локализован в плазмалемме [13].
Цель настоящей работы заключалась в изучении действия КФП на растения картофеля в условиях окислительного стресса и выявлении ферментативного источника АФК при участии КФП в пероксидазных реакциях, а также определение антирадикального свойства КФП по отношению к супероксид-аниону в сравнении с действием индивидуальных антиоксидантов — салидрозида и аскорбиновой кислоты.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования служили растения картофеля (Solanum tuberosum L.) сорта Дезире, поддерживаемые в пробирочной культуре на агари-
зованной среде с половинной дозой МС-солей и 1% сахарозой. Растения культивировали на свету (освещенность 2.5—3.0 клк, лампы ЛБ80) при фотопериоде 18 ч и температуре 24—26°С в камере фитотрона ИФР РАН. Для анализа использовали листья 4-недельных растений.
Применение КФП и индуктора окислительного стресса параквата.
Препарат КФП был предоставлен проф. А.П. Дас-калюком (АН Республики Молдова) и представлял собой фракцию фенилпропаноидов из экстракта корней и корневищ родиолы розовой (Rhodiola rosea L). Расчет концентраций КФП производили по молекулярной массе розавина, который содержится в экстракте родиолы розовой в значительных количествах и имеет высокую биологическую активность, совпадающую с биологической активностью препаратов на основе родиолы розовой, а также считается диагностическим веществом, так как не содержится в других видах родиолы [3]. В экспериментах использовали КПФ в концентрации 100 мкМ. Проведенные нами ранее исследования на клетках диоскореи дельтовидной [14] показали, что концентрация КФП 100 мкМ была предельной, при которой он не проявлял токсичность и имел высокую антиокислительную активность. Растения обрабатывали КФП в течение 30 мин, заливая раствор препарата в пробирки до полного погружения растения в раствор. После 30 мин экспозиции раствор удаляли. Реакцию растений на последействие КФП изучали в интервалах — от 1 ч до 1 суток после обработки.
Окислительный стресс индуцировали с помощью специфического прооксиданта — параквата (метилвиологена). Обработку паракватом в концентрации 50 мкМ проводили, заливая растения раствором на 15 мин. При исследовании действия КФП и параквата вначале проводили обработку растений погружением в раствор КФП (100 мкМ, 30 мин), а затем, после удаления раствора, обрабатывали паракватом (50 мкМ, 15 мин). Контролем служили исходные растения после 30-минутной обработки дистиллированной водой.
Антирадикальную активность по отношению к супероксид-аниону определяли по методу, описанному в работе [15], используя показатель (% ингибирования), который отражает долю, на которую снижается концентрация супероксида в системе под действием КФП. Система генерации супероксид-аниона была использована аналогично таковой при определении активности СОД (см. ниже определение активности СОД) и заключалась во взаимодействии метионина и рибофлавина при освещении, а в качестве детектора супероксида использовали нитросиний тетразо-лий. Для сравнения с действием КФП применяли эквиваленты аскорбиновой кислоты и салидро-
зида. Последний был получен из корней и корневищ родиолы розовой в ВИЛАР (Москва) и в виде кристаллического порошка предоставлен для проведения экспериментов.
Содержание вторичных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали по ТБК-те-сту с образованием окрашенных комплексов тио-барбитуровой кислоты при высокой температуре в кислой среде. Содержание ТБК-активных продуктов (ТБК-АП) рассчитывали с использованием коэффициента экстинкции малонового диаль-дегида, равного 155/(ммоль см) и выражали в мкмоль/г сырой массы [16].
Определение активности ферментов. После гомогенизации листьев (200—250 мг) в 0.1 М калий-фосфатном буфере соответствующего рН (7.8 — для СОД и 6.7 — для ПО), гомогенат центрифугировали при 10 000 g в течение 10 мин, и полученный супернатант использовали для определения активности ферментов.
Общую активность супероксиддисмутазы (СОД, КФ 1.15.1.11) определяли по известному методу [17] и выражали в отн. ед./г сырой массы.
Активность гваякол-зависимой формы перок-сидазы (КФ 1.11.1.7) определяли по изменению оптической плотности при 470 нм реакционной смеси. Активность пероксидазы рассчитывали по количеству окисленного г
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.