ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 1, с. 131-136
УДК 581.1:577.214
СТРУКТУРА ДЕГИДРИН-ПОДОБНОГО ГЕНА ТАБНМ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ И УЧАСТИЕ АБК И 24-ЭПИБРАССИНОЛИДА
В АКТИВАЦИИ ЕГО ЭКСПРЕССИИ
© 2007 г. Ч. Р. Аллагулова, Ф. Р. Гималов, А. М. Авальбаев, А. Р. Сахабутдинова, Р. А. Юлдашев, Ф. М. Шакирова
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, Уфа
Поступила в редакцию 09.06.2006 г.
Исследована структура проклонированного фрагмента дегидрин-подобного гена пшеницы (ТгШсит aestivum L.), обозначенного как TADHN. Сравнительный анализ нуклеотидной и выведенной аминокислотной последовательностей выявил высокую степень гомологии данного фрагмента с таковыми dhn8 гена дегидрина ячменя и генов дегидринов семейства wcor пшеницы. В выведенной аминокислотной последовательности фрагмента TADHN обнаружен 15-звенный участок: ЕККСБЬЕ-KIKEKLPG, соответствующий высококонсервативному К-сегменту дегидринов. Выявлено, что обработка проростков пшеницы 3.7 мкМ АБК и 0.4 мкМ 24-эпибрассинолидом оказывала в целом сходный по динамике стимулирующий эффект на экспрессию TADHN гена, что указывает на вовлечение дегидринов в спектр защитного действия этих фитогормонов на растения пшеницы.
ТгШсит aestivum - дегидрин-подобный белок - клонирование фрагмента гена - АБК - 24-эпибрас-синолид
ВВЕДЕНИЕ
Растения, в силу прикрепленности к месту обитания, вынуждены приспосабливаться к постоянно изменяющимся условиям произрастания. В основе способности растений адаптироваться к воздействию стрессовых факторов разной природы лежат изменения в генной активности. Неблагоприятные факторы окружающей среды обычно на фоне торможения клеточного метаболизма вызывают индукцию экспрессии ряда генов, в частности, кодирующих стрессовые белки, синтез которых в растениях в нормальных условиях произрастания обычно не наблюдается [1]. Среди них особое место принадлежит дегидринам, экспрессия генов которых и накопление их белковых продуктов индуцируется в условиях засухи, засоления, низкотемпературного стресса, вызывающих нарушение водного режима [2-4]. Дегидри-ны относятся к обширному классу LEA-белков (от Late embryogenesis abundant), характерных для позднего эмбриогенеза растений в период обезвоживания зародышей семян и обнаруживаемых во всех таксономических группах в царстве растений [2, 5]. Класс LEA-белков включает, по меньшей мере, 5 разнородных белковых групп, при этом
Сокращение: ЭБ - 24-эпибрассинолид.
Адрес для корреспонденции: Шакирова Фарида Минниха-новна. 450054 Уфа, просп. Октября, 71. Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН. Факс: 007 (3472) 35-61-00; электронная почта: shakirova@anrb.ru
дегидрины объединены в самостоятельную II группу или D 11 семейство LEA-белков [2, 6]. Важно подчеркнуть, что в сравнении с другими стрессовыми белками, индуцируемыми в тканях вегетирующих растений водным дефицитом, дегидрины являются наиболее многочисленными [7, 8]. Выявлено, что дегидрины локализуются, главным образом, в цитоплазме и ядрах клеток растений, подвергнутых водному стрессу, хотя некоторые из них обнаруживаются в митохондриях [9] и хлоропластах [10].
На основании сравнительного анализа нуклео-тидных и соответствующих аминокислотных последовательностей была разработана классификация дегидринов, согласно которой различают 5 классов этих белков: YnSK2, Кп, К^, SKn и Y2Kn [2, 11]. Принадлежность дегидринов к перечисленным классам определяется наличием в них консервативных участков, условно обозначенных как К-, Y- и S-сегментов, при этом К-сегмент, богатый лизином 15-звенный аминокислотный участок, является обязательным для всех дегидринов. Кроме того, в дегидринах выявлены менее консервативные области, условно обозначенные ф-сегментами, богатые полярными аминокислотными остатками, либо глицином, либо пролином и аланином [2, 11, 12].
На сегодняшний день получено значительное количество экспериментальных данных о существовании множественных путей регуляции экспрессии генов дегидринов, что, по-видимому, обу-
131
9*
словлено наличием в их промоторных областях разнообразных комбинаций цис-регуляторных элементов, таких как, например, ABRE- (от ABA-responsive element) и DRE- (от Drought-responsive element) элементов [7, 12]. Поэтому не удивительно, что экспрессия генов дегидринов может индуцироваться разнообразными стрессовыми факторами, а также обработкой АБК [7, 12, 13]. Следует заметить, что в стрессовых условиях в тканях растений наблюдается существенное накопление АБК, поэтому ей отводят ключевую роль в передаче стрессовых сигналов [14, 15]. Сочетание данных о накоплении дегидринов в тканях вегетиру-ющих растений в ответ на неблагоприятные воздействия, а также особенности строения и физико-химических свойств этих белков указывают на вероятность их участия в формировании стрессоустойчивости растений [2, 9, 11, 12]. Действительно, выявлена зависимость между устойчивостью различных видов растений к действию засухи, засоления и гипотермии и уровнем экспрессии генов дегидринов [1, 2, 11]. Организация белковых молекул дегидринов обеспечивает возможность их участия в предотвращении деградации биополимеров, способствуя тем самым сохранению целостности клеточных структур в условиях обезвоживания [2, 11, 13].
Все вышеизложенное позволяет сделать вывод о важной роли дегидринов в формировании устойчивости растений. Особый интерес представляет изучение дегидринов пшеницы. К настоящему времени выявлено немало белков со свойствами дегидринов у пшеницы [1, 9, 13, 16, 17]. Вместе с тем, в отличие от генов дегидринов ячменя с установленной хромосомной локализацией и расшифрованными полноразмерными последовательностями [7, 12], сведения о генах дегидринов пшеницы и механизмах регуляции их активности весьма ограничены.
В связи с этим цель настоящей работы заключалась в определении нуклеотидной последовательности полученного нами фрагмента гена де-гидрина пшеницы TADHN и использовании его для изучения гормональной регуляции экспрессии генов дегидринов в растениях пшеницы.
МЕТОДИКА
Компьютерный анализ зарегистрированных в базе данных NCBI нуклеотидных последовательностей дегидринов злаков осуществляли с использованием пакета компьютерных программ DNASTAR ("LaserGene", США). Олигонуклеотидные прайме-ры 5'CATCGATGAGAACGGTGAGGTG3' и 5'TTGTCCATGATCTTGCCCAGTAGG3' были подобраны к консервативному участку кодирующей области (2-ой экзон) dhn8 гена дегидрина ячменя с использованием модуля Primer Select пакета программ DNASTAR. Тотальную ДНК
пшеницы выделяли фенольно-детергентным методом [18]. Для этого 4-дневные проростки пшеницы Triticum aestivum L. сорта Жница гомогенизировали жидким азотом, экстрагировали ДНК буфером, содержащим 100 мМ Трис-HCl (pH 8.0), 20 мМ ЭДТА, 1%-ный SDS в соотношении 1 : 10 (масса/объем). ДНК после очистки использовали в ПЦР. Амплификацию фрагмента ДНК дегидрина пшеницы проводили посредством ПЦР с использованием буфера (67 мМ Трис-HCl (pH 8.5), 16.6 мМ (NH4)2SO4, 1.5 мМ MgCl2, 0.01% Tween-20), 0.25 мМ каждого dNTP, 30-50 нг геномной ДНК пшеницы, 10 пМ праймеров, 1 ед. ДНК-Taq-полимеразы. ПЦР проводили в приборе МС2 Терцик ("ДНК-Технология", Россия). Отжиг праймеров на ДНК проводили при 61°С в течение 1 мин. После амплификации аликвоту реакционной смеси, содержащей амплифицированную ДНК, фракционировали методом электрофореза в 1.0-1.5%-ном агарозном геле в ТАЕ- или ТВЕ-буфере при напряжении 10 В на 1 см длины геля. В качестве маркеров использовали ДНК фага X, расщепленную рестриктазой BstEII. После препаративного гель-электрофореза ПЦР-продукт элюировали из легкоплавкой агарозы [19] и клонировали в плазмидном векторе pGEM-TEasy ("Promega", США). Плазмидную ДнК со вставкой использовали для секвенирующих реакций, которые проводили в приборе ABI Prism 310 Genetyc Analyzer Systems ("Applied Biosystems", США). Нуклеотидную последовательность и выведенную аминокислотную последовательность полученного ПЦР-продукта сравнивали с таковыми дегидринов злаков, зарегистрированными в базе данных NCBI, с использованием модуля MegAlign пакета программ DNASTAR.
В опытах по оценке влияния фитогормонов на уровень экспрессии TADHN гена дегидрина пшеницы использовали 4-дневные проростки пшеницы. Семена после стерилизации 96%-ным этанолом проращивали в течение 3 суток в кюветах на фильтровальной бумаге, смоченной водопроводной водой, при 21-23°С, 16-часовом световом дне и освещенности 15 клк. После отделения эндосперма проростки корнями помещали в раствор 2%-ной сахарозы на сутки для снятия раневого эффекта [20]. Затем 4-дневные проростки инкубировали на смеси 2%-ной сахарозы и 3.7 мкМ АБК или 0.4 мкМ 24-эпибрассинолида (ЭБ). В ходе инкубирования на растворах фитогормонов проростки фиксировали в жидком азоте по 15 шт. в каждой навеске для выделения РНК. Контролем служили проростки, инкубированные на растворе 2%-ной сахарозы.
РНК выделяли с использованием гуанидинтио-цианатного буфера [21]. Аликвоты РНК, обработанные в растворе формальдегида и формалина, переносили на нитроцеллюлозный фильтр 0.22 мкм ("Schleicher and Schuell", Германия), как описано в
—GTK-^CGATC&CÄACGGTGA^—GMGCTCÄRGGAGÄAGCTGCCO^^CAÄGGACÄCCGAGGGTGÄGCÄCG^ -1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-Г
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130
H.vulgare (Ит8 ген T aestiyum W^OR 4Ю мРНК
T desrnwn WCO*- 410b мРНК —GTGäTCGACGACAÄG®^ —GAAGCTCCAGGAG^^
ТАЛЫМИ WCOR 410С мРНК
■-CATGACRCCG&CGTCGTCGTCGRGMGATCGACGGTGACGTGMGAC^^
140
150
160
170
180
190
200
210
220
230
240
250
260
GATGGCCCCC--GCGTCTGTTCAGACTCAC-
--CATGACACCGACGTCGTCGTCGAGMGATCGACGGCGACGCGMGACAGAGGCCACACCGGCAGTGCCCGAGGAGGAGMGAMGGCTTCT
H.vulgare dhn8 ген T. aestivum WCOR 410 мРНК T. aestivum WCOR 410b мРНК Т. aestivum WCOR 410c мРНК TADNH
TGGAAMGATCAAGGAGAAGCTGCCC^^ ■ -1-1-1-1-1-
270
280
290
300
310
320
330
340
350
360
370
380
390
TGGAAAAGATCMGGAGMGCTGCCCGGCGGCCACMGMGCCGGAGGACGCTGCC-TGGAAMGATCAAGGAGÄAGCTGCCCGGCX3GCCACM ■
-GCGGTGCCCGTCACGCACGCTGCTCCAGCGCCAGT-GCACGCGCCTGCGC --GCGGTGCCCGTCACGCACGCTGCTCCi^^
H.vulgare dhn8 ген T. aestivum WCOR 410 мРНК T aestivum WCOR 410b мРНК T.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.