научная статья по теме СТРУКТУРА И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА VFR PSEUDOMONAS CHLORORAPHIS 449 Биология

Текст научной статьи на тему «СТРУКТУРА И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА VFR PSEUDOMONAS CHLORORAPHIS 449»

ГЕНЕТИКА, 2009, том 45, № 9, с. 1203-1210

= ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ

УДК 577.218:579.22

СТРУКТУРА И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА vfr Pseudomonas chlororaphis 449

© 2009 г. М. А. Веселова1, В. А. Липасова1, М. И. Овадис2, Л. С. Чернин2, И. А. Хмель1

1Институт молекулярной генетики Российской академии наук, Москва 123182;

e-mail: khmel@img.ras.ru

2Отто Варбург Центр сельскохозяйственной биотехнологии, Еврейский университет Иерусалима,

Реховот 76100, Израиль Поступила в редакцию 11.01.2009 г.

В клетках Pseudomonas chlororaphis 449 идентифицирован, клонирован и секвенирован ген vfr, ранее описанный только у Pseudomonas aeruginosa; определена его локализация в хромосоме. Показано, что последовательность аминокислот белка, кодируемого геном vfr у P. chlororaphis 449, имеет идентичность 83% с белком Vfr P. aeruginosa PAO1 и 63% с белком CRP E. coli. Аминокислотные остатки, которые обеспечивают наиболее важные структурные особенности белка CRP, т.е. его связывание с сАМР, РНК-полимеразой и ДНК, были идентичны или высококонсервативны в белках Vfr P. aeruginosa и P. chlororaphis 449.

Клонированный ген vfr P. chlororaphis 449 частично комплементировал мутацию в гене crp в клетках E. coli АМ306, увеличивая в 10 раз синтез Р-галактозидазы, зависимый от белка CRP. В отличие от P. aeruginosa, белок Vfr в клетках P. chlororaphis 449 не участвует в регуляции синтеза N-ацил-гомосеринлактонов.

Quorum Sensing (QS) - регуляторный механизм, посредством которого большое количество видов бактерий контролирует экспрессию определенных групп генов в ответ на повышение плотности их популяции. У грамотрицательных бактерий лучше всего изучены QS-системы, функционирующие с участием аутоиндукторов N-ацил-гомосеринлактонов (АГЛ). Такие системы включают два белка, гомологичных LuxR и LuxI белкам Vibrio fischeri, - рецепторный белок и синтазу АГЛ соответственно.

QS-системы регуляции связаны с другими клеточными глобальными регуляторными сетями; в контроле их функционирования принимают участие различные дополнительные факторы [1-4].

У патогенной бактерии Pseudomonas aeruginosa был обнаружен гомолог глобального транскрипционного регулятора CRP Escherichia coli, названный Vfr (Virulence factor regulation), контролирующий QS-регуляцию [5, 6]. Vfr регулирует функционирование LasI/LasR QS-системы P. aeruginosa, увеличивая продукцию регулятора LasR, и активирует синтез регулятора RhlI второй QS-системы, RhlI/RhlR. Вместе две системы осуществляют контроль над экспрессией вирулентных факторов и других экзо-продуктов у P. aeruginosa. Таким образом, Vfr осуществляет регуляцию последующего каскада генов, контролируемых QS [6-8]. В клетках P. aeruginosa Vfr является глобальным регулятором экспрессии генов. Результаты протеомики показывают, что Vfr оказывает положительный или отрицательный эффект на продукцию по крайней мере 60 белков у P. aeruginosa [9].

В настоящее время роль белка Vfr и его связь с QS-системой изучены только у P. aeruginosa. В данной работе проведено исследование гена vfr другого вида Pseudomonas, P. chlororaphis. Бактерии P. chlororaphis, обитающие в почве и ризосфере растений, являются антагонистами фитопатогенных грибов и бактерий, вызывающих заболевания растений, у них обнаружены две QS-системы LuxI-LuxR типа: PhzI-PhzR и CsaI-CsaR. Показано, что у P. chlororaphis QS-системы участвуют в регуляции антагонистической активности в отношении фитопатогенных микроорганизмов, синтеза феназиновых антибиотиков и внеклеточных протеаз [10-12]. В этой работе мы идентифицировали, клонировали и се-квенировали ген vfr P. chlororaphis 449, определили его локализацию в хромосоме. Было показано, что белок Vfr P. chlororaphis 449 гомологичен белку Vfr P. aeruginosa и белку CRP Escherichia coli; клонированный ген vfr частично комплементировал мутацию в гене crp E. coli. В отличие от P. aeruginosa, белок Vfr в клетках P. chlororaphis 449 не участвует в регуляции синтеза АГЛ, а также процессов, зависимых от QS-систем, - синтеза феназинов, внеклеточных протеаз, антагонистической активности бактерии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактерии, среды. Штаммы бактерий, использованные в работе, приведены в табл. 1. Штамм P. chlororaphis 449 был выделен из ризосферы кукурузы в Киевской области (Украина) [12]. Штаммы E. coli выращивали при температуре

1203

4*

Таблица 1. Штаммы бактерий и плазмиды, использованные в работе

Штаммы бактерий и плазмиды Характеристика Источник

Pseudomonas

P. chlororaphis 449 Прототроф. Синтезирует АГЛ и феназины [12]

P. chlororaphis 449 v/r::Gm Инсерционный мутант 449, vfr::Gm, Gmr Данная работа

P. chlororaphis 30-84 Прототроф. Синтезирует АГЛ и феназины L. Thomashow (USA)

P./luorescens 2-79 Прототроф. Синтезирует АГЛ и феназины L. Thomashow (USA)

Escherichia coli K12

S17-1 (X-pir) thi pro hsdR hsdM recA rpsL RP4-2 (Tetr::Mu) (Kmr::Tn7) ^pir [13]

AM306 crp::Tn10, Tcr А.С. Миронов (ВНИИ-Генетика)

AM306/pEXV449 Данная работа

AM306/pHA5 »

АГЛ-биосенсоры

Chromobacterium violaceum CV026 Биосенсор для определения АГЛ, продукция виолацеина. cviI::mini-Tn5 xylE Kmr, Smr, Hgr [14]

Agrobacterium tume/aciens NTL4/pZLR4 Биосенсор для определения АГЛ. Gmr Cbr [15]

Плазмиды

pBluescript II SK- Вектор для клонирования генов, Apr "Stratagene"

pEX18Tc ori ColEl oriT sacB, Tetr; вектор для замещения генов [16]

pEX20T Ptac; Apr [17]

pHA5 pBR322, несущая клонированный ген crp; Tetr Fpr [18]

pGEM-v/r pGEM-T Easy, содержащая 2, 1 тпн фрагмент vfr, ампли-фицированный с 449 с помощью ПЦР. Apr Данная работа

pSK-v/r pBluescript II SK-, содержит 0.97 тпн EheI фрагмент гена vfr из pGEM-vfr, клонирован по SmaI сайту. Apr »

pEX18Tc-v/r pEX18Tc, содержит 0.97 тпн SacI-HindIII фрагмент гена vfr из pSK-vfr. Tetr »

pEX18Tc-v/r::Gm pEX18Tcc-vfr, содержит 0.91 тпн SphI фрагмент гена устойчивости к Gm из p34S-Gm, клонированный в SphI сайт внутри гена vfr. Tetr, Gmr »

pSK-V1124 pBluescript SK-, содержит 2.2 тпн PstI фрагмент хромосомной ДНК P. chlororaphis 449, содержащий ген vfr. Apr »

37°С, все остальные бактерии выращивали при температуре 30°С. Штаммы поддерживали на среде LB или LA [19]. Фитопатогенный гриб Sclerotinia sclerotiorum получен из коллекции лаборатории регуляции экспрессии генов микроорганизмов Института молекулярной генетики РАН. Культуры гриба выращивали на среде PDA (Sigma) при 25 °С. Антибиотики (Россия) добавляли в среду в концентрации: ампициллин (Ар) 100 мкг/мл; тетрациклин (Tc) 20 мкг/мл; гентамицин (Gm) 40 мкг/мл; канамицин (Km) 100 мкг/мл.

Определение продукции АГЛ. Репортерный штамм C. violaceum CV026 высевали штрихами на поверхность среды LA, пересекали их штрихами тестируемых культур, инкубировали 24-48 ч при

30°С. Если тестируемый штамм продуцировал АГЛ, наблюдали окрашивание индикаторного штамма CV026 в фиолетовый цвет за счет синтеза пигмента виолацеина. Интенсивность окраски оценивали визуально [14]. При использовании биосенсора А. Шше/аает NTL4/pZLR4 тестируемые штаммы высевали уколами на поверхность агаризованной среды М9 [19] с 0.4% глюкозы и X-Gal (конечная концентрация 80 мкг/мл), залитой сверху 3 мл верхнего мягкого агара М9 (0.5%), содержащего 0.5 мл ночной культуры сенсора. Чашки инкубировали при 30°С 24-48 ч. О синтезе АГЛ судили по появлению голубых зон гидролиза X-Gal вокруг уколов тестируемых штаммов [15]. Для идентификации АГЛ с помощью тонкослой-

ной хроматографии (ТСХ) получали этилацетат-ные экстракты АГЛ из супернатантов исследованных штаммов и проводили ТСХ, как описано, с разделением АГЛ на обращенно-фазовых ТСХ-пластинках RP18 (Merck, Германия) [12, 15].

Методы работы с ДНК. Выделение геномной ДНК, плазмидной ДНК, рестрикцию, гель-электрофорез в агарозе, лигирование, трансформацию, блот-гибридизацию по Саузерну проводили согласно методикам, описанным в [20]. Ферменты были получены в MBI Fermentas и использованы согласно рекомендациям производителя.

Идентификация гена vfr с помощью ПЦР. Для идентификации использовали праймеры VFR-F 5'-GGTTCGGTCACCATCCTCATCG и VFR-R 5'-TCAGCACGCGTCCGACCATTTC, подобранные по последовательности U16318 гена vfr P. aeruginosa. Условия ПЦР: 94°С 2 мин, 30 циклов 94°С 40 c, 59°С 40 с, 72°С 2 мин, последний цикл 72°С 4мин.

Клонирование гена vfr. Фрагмент ДНК из хромосомы штамма P. ehlororaphis 449, включающий ген vfr, амплифицировали с помощью метода ПЦР с использованием праймеров VFR2-F 5'-AACCGCAACCTGCACACCTTC и VFR2-R 5'-TCTTCAGGATGCTGACCACATC, подобранных по последовательности AE004500 (P. aeruginosa) из ГенБанка. Условия ПЦР: 94°С 2 мин, затем 30 циклов 94°С 40 с, 62°С 40 с, 72°С 2 мин, последний цикл 72°С 4 мин. Амплифицированный фрагмент ДНК был лигирован с ДНК вектора pGEM-T Easy (Promega), в результате была получена ре-комбинантная плазмида pGem-vfr со вставкой 2.1 тпн, содержащей ген vfr. Секвенирование клонированной последовательности ДНК проводили, используя праймеры VFR-F, VFR-R, VFR2-F, VFR2-R, в Межинститутском центре коллективного пользования "ГЕНОМ" (http:www.genome-centre. narod.ru/). Поиск гомологов был проведен на сайте NCBI с помощью программы BLAST.

Полный ген vfr был клонирован из геномной библиотеки P. ehlororaphis 449. Фрагменты хромосомной ДНК, разрезанные рестриктазой PstI, были лигированы с ДНК вектора pBluescript II SK-; клетки E. eoli XL1 Blue были трансформированы лигазной смесью. Клоны, содержавшие вставку в полилинкере вектора, были проверены на присутствие гена vfr с помощью ПЦР с использованием праймеров VFR-F и VFR-R. Из рекомби-нантной плазмиды, содержащей ген vfr, EheI фрагмент ДНК размером 0.97 тпн был переклонирован в сайт SmaI экспрессионного вектора pEX20T. Среди полученных клонов с помощью рестрикционного анализа была отобрана плазмида, в которой транскрипция гена vfr происходила с промотора Ptac; полученная рекомбинантная плазмида была названа pEXV449.

Получение инсерционного мутанта P. ehlororaphis 449 с инактивированным геном vfr. Для по-

лучения мутанта был использован метод замены генов [16, 21]. EheI-фрагмент гена vfr из плазмиды pGem-vfr был клонирован по сайту SmaI в вектор pBluescript II SK-, затем из полученно

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком