ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ. Серия Б, 2014, том 56, № 1, с. 60-63
ПОЛИМЕРНЫЕ ГЕЛИ
УДК 541.64:547.6
СТРУКТУРА И СВОЙСТВА ГИДРОГЕЛЕЙ, ПОЛУЧЕННЫХ С УЧАСТИЕМ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО МАКРОМОНОМЕРА1
© 2014 г. Л. И. Валуев, Л. В. Ванчугова, И. В. Обыденнова, И. Л. Валуев
Институт нефтехимического синтеза им. А.В. Топчиева Российской академии наук 119991 Москва, Ленинский пр., 29 Поступила в редакцию 15.03.2013 г. Принята в печать 13.06.2013 г.
Изучена сополимеризация макромономера ингибитора протеолитических ферментов с акрилами-дом и N^N'-метиленбисакриламидом в водном растворе под действием окислительно-восстановительного катализатора. Показано, что введение в полимеризующуюся систему передатчика цепи — меркаптоуксусной кислоты приводит к изменению структуры образующегося гидрогеля, т.е. снижению количества пор большого размера. При этом достигается существенное повышение степени вхождения макромономера в состав гидрогеля и создаются благоприятные условия для проявления макромономером его биологической активности.
DOI: 10.7868/S2308113914010112
Одними из наиболее развивающихся областей применения синтетических полимерных гидрогелей являются медицина и биотехнология, которые нуждаются в биосовместимых протезах мягких органов и тканей, в новых лекарственных формах с пролонгированным действием лекарства и(или) его целевой доставкой к органу-мишени, в разделяющих средах для аффинной хроматографии и т.д. Самой ответственной стадией изготовления большинства таких изделий можно назвать присоединение биологически активного вещества (БАВ) к гидрогелю. Эта реакция должна быть достаточно простой, применимой к большинству известных гидрогелей, а главное — обеспечить сохранение БАВ присущей ему активности. В наибольшей степени данным требованиям удовлетворяет сополимеризация ненасыщенного производного БАВ, в том числе белковой природы (макромономера), с гидрофильным мономером и сшивающим агентом [1, 2].
Присоединение макромономера к цепи синтетического полимера непосредственно на стадии образования полимерной сетки, вероятно, создает неплохое стерическое соответствие между стенками пор гидрогеля и глобулой белка, что и приводит к получению гидрогеля с достаточно высокой биологической активностью.
1 Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (код проекта 1208-00123) и Программ Отделения химии и наук о материалах РАН (№ 3 и 7).
E-mail: valuev@ips.ac.ru (Валуев Лев Иванович).
Цель настоящей работы — выяснить возможность регулирования биологической активности иммобилизованных макромономеров путем направленного изменения структуры гидрогелей, формируемых с их участием [3]. Регулирование структуры, в частности распределения пор по размерам и степени набухания гидрогелей в водных растворах, достигалось с помощью обнаруженного в работе [4] явления уменьшения размеров пор гидрогелей при проведении полимеризации в присутствии передатчика цепи. В качестве БАВ в работе применяли природный ингибитор протеолитических ферментов овомукоид, выделенный из белка утиных яиц. Это соединение уже нашло клиническое применение в составе анти-протеиназного препарата "Овомин" и гемосор-бента "Овосорб", предназначенного для удаления из крови пациентов активированных протео-литических ферментов методом гемосорбции [5].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали акриламид; М,№-мети-ленбисакриламид; персульфат аммония фирмы "Диаэм" (Россия); М,М,М',№-тетраметилэтилен-диамин и меркаптоуксусную кислоту (МУК) фирмы "Serva" (США); утиный овомукоид (ОМ) с M = 3.1 х 104 фирмы "Белмедпрепараты" (Беларусь); овальбумин из белка куриных яиц (ОА) с М = 4.4 х 104; человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) с М = 6.7 х 104; алкогольдегидрогеназу из дрожжей (АДГ) с М = 14.1 х 104 — все вещества фирмы "Sigma" (США) использовали без дополнительной очистки.
СТРУКТУРА И СВОЙСТВА ГИДРОГЕЛЕЙ
61
Макромономер ОМ (МОМ) синтезировали путем ацилирования аминогрупп ОМ хлорангид-ридом акриловой кислоты [6].
Полиакриламидные гидрогели получали полимеризацией при комнатной температуре и давлении 10—12 мм рт.ст. смеси, содержащей (0.3— 2.5) х 104 моль/л МОМ, 1.4 моль/л акриламида, 0.032 моль/л ^№-метиленбисакриламид и 0.0012—0.012 моль/л МУК. Инициатором служила окислительно-восстановительная система, содержащая эквимольное количество персульфата аммония и ^^№,№-тетраметилэтилендиамина (0.0044 моль/л).
Степень набухания гидрогелей оценивали гравиметрически. Степень набухания Sr рассчитывали по формуле
Sr = m1/m2 — 1, где m1 и m2 — масса равновесно набухшего и лио-фильно высушенного гидрогеля соответственно.
Проницаемость гидрогелей изучали при помощи набухшего в воде геля, который измельчали, продавливая его в механическом прессе через сито с диаметром пор 1 мм. К 2 мл геля добавляли 4 мл раствора белка с концентрацией 6.5 х 10-5 моль/л для ОА, 3 х 10-5 моль/л для ЧСА и 1.4 х 10-5 моль/л для АДГ. Смесь оставляли при 4°С до установления постоянного значения оптической плотности раствора белка, измеряемой на спектрофотометре "Hitachi-3410" (Япония) при 280 нм (обычно, не более 48 ч). Концентрацию белка в исходном растворе и в растворе после инкубирования с гелем оценивали с помощью построенной для каждого белка калибровочной зависимости. Учитывая соотношение объема фаз, рассчитывали количество пор, доступных для каждого белка, принимая за 100% количество пор, доступных для воды.
Для определения емкости гидрогелей по ферментам 5 г геля инкубировали с 10 мл раствора 40 мг фермента в 0.05 моль/л трис-НС\ —буфере, рН 8.0, содержащем 0.5 моль/л NaCl, при перемешивании до установления постоянного значения оптической плотности раствора фермента при 280 нм (обычно, не более 2 ч). Связавшийся фермент элюировали 0.2 моль/л КС1, рН 2.0. Концентрацию выделившегося фермента определяли спектрофотометрически.
Электронномикроскопические исследования гидрогелей проводили на электронном микроскопе "Jeol, JSM-35" (Япония). Для подготовки образцов использовали лиофильную сушку.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Основными задачами, решаемыми при создании конъюгатов БАВ и синтетических полимерных гидрогелей, являются максимальное использование БАВ как наиболее дорогого компонента
«а,
jf (б) т
10-5 м
I_I
Рис. 1. Электронномикроскопические фотографии гидрогелей, полученных в отсутствие (а) и в присутствии (б) МОМ, — образцов 5 и 8 в таблице соответственно.
системы при введении его в состав конъюгата, а также создание оптимальной структуры гидрогеля для проявления БАВ присущей ему активности. В работе [4] мы обнаружили, что проведение реакции радикальной сополимеризации гидрофильного мономера и бифункционального сшивающего агента в условиях ограничивающих рост образующегося на первой стадии процесса водорастворимого полимера, позволяет уменьшить содержание в гидрогеле обычно малоэффективных пор большого размера. Этот эффект достигался введением в реакцию передатчика цепи или проведением реакции по механизму псевдоживой радикальной полимеризации. В настоящей работе предпринята попытка выяснить, в какой степени данное явление сохраняется при полимеризации макромономеров, а также в какой степени оно позволяет регулировать степень вхождения БАВ в состав гидрогеля и его биологическую активность. В качестве БАВ был использован ово-
62 ВАЛУЕВ и др.
Зависимость некоторых свойств гидрогеля от условий его получения
Концентрация Доступность пор геля Емкость геля по химотрипсину, мг/мг
Образец, в исходной смеси Бг для молекул,% Концентрация
№ МОМ х 104 , моль/л МУК х 103, моль/л ОА ЧСА АДГ ОМ в геле, мг/г
1 - - 10.2 89 82 49 - -
2 0.3 - 10.7 81 70 47 0.4 0.57
3 1.2 - 11.4 84 66 44 1.5 0.50
4 2.5 - 11.9 87 72 40 3.1 0.52
5 - 1.2 11.9 83 74 42 - -
6 0.3 1.2 12.4 78 67 38 0.5 0.61
7 1.2 1.2 15.1 83 65 34 1.7 0.58
8 2.5 1.2 16.8 80 69 30 3.0 0.65
9 - 2.9 13.0 77 68 40 - -
10 0.3 2.9 14.8 76 73 31 0.5 0.68
11 1.2 2.9 17.5 84 70 30 1.7 0.66
12 2.5 2.9 21.7 81 65 26 2.8 0.70
13 - 5.8 16.5 80 71 29 - -
14 0.3 5.8 18.1 82 65 24 0.4 0.65
15 1.2 5.8 20.3 84 74 21 1.5 0.68
16 2.5 5.8 23.6 82 71 20 2.6 0.72
17 - 12 22.4 84 75 33 - -
18 0.3 12 26.3 90 63 26 0.3 0.73
19 1.2 12 29.7 85 70 20 1.0 0.76
20 2.5 12 32.2 86 70 20 2.0 0.77
Примечание. Точность измерения Бг ±0.5, доступности пор ±4%, концентрации ОМ в геле ±8%, емкости геля по химотрип-сину 0.03 мг.
мукоид — гликопротеин с М = 3.1 х 104, способный одновременно ингибировать активность двух молекул трипсина и одной молекулы химо-трипсина [7].
Гидрогели синтезировали сополимеризацией акриламида, макромономера ОМ и БИС в присутствии передатчика цепи — меркаптоуксусной кислоты. Результаты суммированы в таблице. Видно, во-первых, что введение в полимеризую-щуюся систему макромономера способствует увеличению степени набухания гидрогелей примерно в 1.5 раза при повышении концентрации МОМ до 2.5 х 104 моль/л. Во-вторых, количество пор, проницаемых для белков с М = 4.4 х 104 и 6.7 х 104, существенно не изменяется и остается на уровне 80 и 70% соответственно, в то время как количество больших пор, доступных для молекул белков с М = 14 х 104 снижается почти в 2 раза. Эти эффекты, скорее всего, обусловлены описанными в работе [8] особенностями сшивания растворимых сополимеров акриламида и макромономера, при котором звенья макромономера концентрируются на поверхности пор и пре-
пятствуют образованию толстых стенок, разделяющих поры гидрогеля. Различие в строении гидрогелей отчетливо видно на электронномик-роскопических фотографиях (рис. 1). Очевидно, что в процессе препарирования образцов структура гидрогелей может изменяться и, следовательно, данным фотографиям нельзя придавать абсолютного значения. Вместе с тем, они отчетливо отражают тенденцию к гомогенизации параметров структуры при проведении полимеризации в присутствии макромономера.
Такое строение гидрогеля (большое количество мелких пор с тонкими стенками), вероятно, и является причиной высокой степени вхождения макромономера в состав гидрогеля и его повышенной биологической активности. Если в отсутствии передатчика цепи
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.