ПОВЕРХНОСТЬ. РЕНТГЕНОВСКИЕ, СИНХРОТРОННЫЕ И НЕЙТРОННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ, 2015, № 1, с. 5-9
УДК 539:548.732
СТРУКТУРА И ТОКСИЧНОСТЬ ВОДНЫХ РАСТВОРОВ ФУЛЛЕРЕНА С60
© 2015 г. Е. А. Кизима12, *, А. А. Томчук1, Л. А. Булавин2, В. И. Петренко12, Л. Алмаши3, М. В. Коробов4, Д. С. Волков4, И. В. Михеев4, И. В. Кошлань5, Н. А. Кошлань5, П. Блаха56, М. В. Авдеев1, В. Л. Аксенов1, **
Лаборатория нейтронной физики им. И.М. Франка Объединенного института ядерных исследований,
141980Дубна, Московская область, Россия 2Киевский национальный университет им. Тараса Шевченко, физический факультет, 03127Киев, Украина 3Institute for Solid Physics and Optics Wigner Research Centre for Physics, H-1525 Budapest, Hungary 4Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет,
119991 Москва, Россия 5Лаборатория радиационной биологии Объединенного института ядерных исследований,
141980Дубна, Московская область, Россия 6Faculty of Nuclear Sciences and Physical Engineering, Czech Technical University in Prague,
166 36 Prague, Czech Republic *E-mail: alyona_kizima@mail.ru, **E-mail: aksenov@nf.jinr.ru, Поступила в редакцию 22.01.2014 г.
В работе проводится сравнение двух видов растворов фуллерена С60 в отношении их структурных особенностей и токсических свойств. Результаты обсуждаются с точки зрения их потенциального медико-биологического использования. Кластерное состояние фуллерена на наноуровне в данных растворах анализируется с помощью малоуглового рассеяния нейтронов. Эксперименты по цито-токсичности указанных систем на клетках V-79 китайского хомячка показывают отсутствие токсичных эффектов в растворах.
Ключевые слова: фуллерен, водные растворы, токсичность, структура, малоугловое рассеяние нейтронов
DOI: 10.7868/S0207352815010126
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время важными являются проблемы нанотоксикологии и биобезопасности используемых и перспективных наноматериалов [1, 2]. Современные углеродные наноматериалы (фулле-рены, наноалмазы, нанотрубки и пр.) все чаще проходят испытания в разработках комплексов для доставки лекарств, а также как основа противоопухолевых, антибактериальных и других медицинских препаратов [3—5]. В этой связи большой интерес проявляется к различным методам получения водных растворов углеродных нанообъек-тов, в том числе и фуллерена. Сюда следует отнести растворы фуллерена С60, включая как растворы модифицированного С60 (солюбилизация, комплексы с полимерами), так и растворы без использования стабилизаторов (конденсация, метод замены растворителя) [6]. Вопрос о токсичности такого рода систем в полной мере не изучен. В какой-то степени это вызвано различиями в методиках приготовления водных растворов С60, что приводит к разным структурным параметрам растворов [6] с точки зрения их коллоидной органи-
зации. Вместе с тем, существует мнение [7, 8], что наличие кластеров в водных растворах С60 может быть причиной образования супероксидных анионов, которые приводят к разрушению мембран клеток. Поэтому до сих пор активно ведутся работы по усовершенствованию существующих и разработке новых методов получения водных нетоксичных растворов С60 с хорошим мембранотроп-ным действием за счет низкой полидисперсности и меньших размеров кластеров, в идеальном случае — растворов отдельных молекул С60. Таким образом, связь структурных параметров и токсичности растворов С60 определяет необходимость детального структурного описания синтезируемых систем.
Дополнительным фактором, обуславливающим интерес к поиску путей синтеза растворов С60 в воде, близких к молекулярным, является то, что биологическая активность С60 возрастает с приближением к молекулярному состоянию. Следует отметить, что все без исключения существующие на сегодня методы получения водных растворов фуллерена С60 дают коллоидные дисперсии, где
6
КИЗИМА и др.
фуллерен полностью находится в кластерном состоянии. Недавно было показано [9, 10], что использование в качестве первичного растворителя N-метилпирролидона (NMP) при последующем смешивании с водой позволяет уменьшить размер агрегатов в конечной смеси. При этом в смеси наблюдаются и отдельные неагрегированные фуллерены. Из-за хорошей смешиваемости достаточно токсичного NMP с водой его экстрагирование из смеси представляет собой довольно трудную задачу. Однако факт образования раствора с одиночными фуллеренами и возможность уменьшения размера кластеров являются мотивацией исследования смешанных (NMP/вода) растворов и сравнения их с чисто водными растворами фуллерена. Естественным способом уменьшения токсичности в этом случае оказывается сильное разбавление водой при сохранении значимых с биологической точки зрения концентраций фуллерена в смеси.
В настоящей работе исследуются водный раствор С60, ВДФ-60, приготовленный методом замены растворителя, и раствор C60/H2O(NMP) с малым содержанием NMP. Структура ВДФ-60 на наноуровне (до 100 нм) анализируется с помощью малоуглового рассеяния нейтронов (МУРН) и сравнивается с литературными данными по аналогичным системам, а также смешанным растворам C60/H2O/(NMP). Для оценки дальнейшей перспективы применения в биологии этих растворов проведены исследования их токсичности на клетках V-79 китайского хомячка, в том числе изучено влияние содержания NMP в смешанных растворах на их токсичность. Конечная цель работы — определение влияния размера кластеров фуллерена в растворе на уровень его токсичности.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Приготовление водной системы Q0/H2O(NMP).
Водная система C60/H2O(NMP) была получена с помощью растворения фуллерена С60 (Фуллере-новые технологии, чистота >99.5%) в N-метил-пирролидоне (Merck, чистота >99.5%) путем перемешивания в течение 6 ч с использованием магнитной мешалки при комнатной температуре. В дальнейшем раствор разбавлялся дистиллированной водой (Millipore) до необходимой концентрации фуллерена так, что в среде с клетками концентрация С60 составляла 0.05 мкг/мл. Доля NMP в таком растворе составляла 0.005%. Увеличение концентрации фуллерена в растворе коррелирует с увеличением доли первичного растворителя (NMP), который в больших дозах проявлял явное токсическое действие на клетки.
Приготовление водной системы ВДФ-60. Водная система ВДФ-60 была получена методом замены растворителя, описанным ранее [11]. Про-
цедура была несколько усовершенствована для получения растворов с большей концентрацией. Фуллерен С60 (НеоТекПродакт, Россия, чистота 99.5%+) растворяли в первичном растворителе, толуоле (Реахим, Россия, химически чистый). Далее первичный раствор смешивали с водой Milli-Q (Millipore) так, что объем органической фазы в сравнении с водной составлял 1 : 5. Смесь подвергали ультразвуковой обработке в течение 12 ч ежедневно на протяжении 23 дней до полного испарения толуола. Затем полученный раствор доводили до кипения и кипятили в течение 15 мин. После этого раствор был отфильтрован при помощи фильтра Шотта с использованием колбы Бун-зена, отделяя частицы фуллерена, не перешедшие в водный раствор. Далее раствор вторично был отфильтрован при помощи микропористого фильтра с диаметром микропор 0.45 мкм и была определена концентрация фуллерена в водном растворе при помощи анализатора общего углерода (ТОС), действующего на основе высокотемпературного (до 1200°С) окисления образцов с последующим доокислением продуктов разложения на слое катализатора. При этом концентрация фуллерена в полученном ВДФ-60 составила 130 ± 2 мкг/мл (выход 54%), что значительно выше получаемой ранее по данной методике — 5 мкг/мл [12]. Такие результаты связаны с тем, что в предложенной модифицированной методике в сравнении с предыдущими процедурами было использовано значительно большее (в 4 раза) количество толуола.
Метод МУРН. Эксперименты по малоугловому рассеянию нейтронов проводились на установке Yellow Submarine на стационарном реакторе Будапештского нейтронного центра (Будапешт, Венгрия). Измерялось и анализировалось дифференциальное сечение рассеяния на единицу объема образца (интенсивность рассеяния), усредненное по радиальному углу ф как функция модуля вектора рассеяния q = (4n/X)sin(9/2), где X — длина волны нейтронов и 9 — угол рассеяния. Использовался квазимонохроматический пучок нейтронов с длиной волны X = 1.175 нм и X = 0.392 нм. Позиционно-чувствительный детектор размером 64 х 64 см размещался за образцом на расстоянии 5.5 м. Таким образом, измеряемый q-диапазон составил 0.06—1.00 нм-1. Для калибровки и приведения кривых рассеяния к абсолютным величинам использовался одномиллиметровый по толщине стандарт H2O [13]. Для измерений МУРН использовались кварцевые кюветы толщиной 1 мм (Hell-ma Analytics). В качестве фоновых образцов служила дистиллированная вода. Все измерения проведены для обычных (недейтерированных) компонентов.
Культивирование клеток. В работе использована культура клеток китайского хомячка линии V-79. Клетки выращивали в растворе полной питатель-
10
о
0.1
0.01
0.001
0.04 г
—I_I_I_I_I_I—
0.1
Яе = 18.8(2) нм
0 20 40 60 г, нм
_|_I_I_I_I_I_|_
q, нм
Рис. 1. Кривая МУРН для системы ВДФ-60. Концентрация фуллерена Сб0 в растворе составляет 0.03 мг/мл. Сплошная линия — модельная кривая, полученная с помощью косвенного преобразования Фурье. Вставка: функция распределения парных расстояний как результат обработки кривой методом косвенного преобразования Фурье.
1
1
ной среды (ППС): 88.5% среды ДМЕМ, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% глутамина, 0.5% гентамицина. Культуру клеток культивировали в стандартных флаконах (Согшп§-Со81аг) с площадью поверхности 25 см2, в которые вносили по 4.5 мл ППС. В каждый флакон помещали 3 х х 105 клеток и добавляли по 0.5 мл исследуемого раствора фуллерена С60 разных концентраций. Конечные концентрации фуллерена в среде с клетками составляли: 0.05 мг/мл, 0.5 мг/мл, 5 мг/мл. Клетки растили при 37°С в атмосфере, содержащей 5% С02.
Через трое суток образовавшийся клеточный монослой, заполнивший 80—90% площади поверхности флакона, обрабатывали последовательно версеном и трипсином для снятия клеток и приготовления клеточной суспензии. Ресуспенди-рованную до одиночных клеток с
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.