ПОЧВОВЕДЕНИЕ, 2015, № 11, с. 1367-1382
БИОЛОГИЯ ПОЧВ
УДК 631.4;574.47
СТРУКТУРА МИКРОБНОГО СООБЩЕСТВА АГРЕГАТОВ ЧЕРНОЗЕМА ТИПИЧНОГО В УСЛОВИЯХ КОНТРАСТНЫХ ВАРИАНТОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ*
© 2015 г. Е. А. Иванова1, О. В. Кутовая2, А. К. Тхакахова2, Т. И. Чернов2, Е. В. Першина1,
Л. Г. Маркина2, Е. Е. Андронов1, Б. М. Когут2
всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии, 196608, Санкт-Петербург, Пушкин-8, ш. Подбельского, 3 2Почвенный институт им. В.В. Докучаева, 119017, Москва, Пыжевский пер., 7 e-mail: ektrnivanova@gmail.com Поступила в редакцию 12.02.2015 г.
Проведено исследование таксономической структуры микробиомов агрегатов различного размера чернозема типичного при помощи секвенирования гена 16S рРНК. Для анализа использовали агрегатные фракции размером <0.25, 2—5 и >7 мм, полученные рассевом почвенных образцов естественной влажности. Наибольшее количество прокариотной биомассы (бактерии, археи) было зафиксировано во фракциях <0.25 мм и агрегатах размером 2—5 мм; при этом биомасса бактерий и архей уменьшалась в ряду залежь > бессменный пар > бессменная озимая пшеница. Наибольшее количество грибов отмечалось во фракции <0.25 мм бессменного пара и во всех исследуемых агрегатных фракциях варианта с бессменной пшеницей. Показано, что система сельскохозяйственного использования оказывает статистически более значимое влияние на структуру прокариотного сообщества чернозема, нежели размер агрегатных фракций. Наибольшим разнообразием отличались образцы залежи, при этом статистически значимые максимумы индексов разнообразия Шеннона и филогенетического разнообразия (PD) были зафиксированы в залежи во фракциях <0.25 и 2—5 мм. В целом фракции мелкого размера (<0.25 мм) отличались большими показателями разнообразия, нежели более крупные структурные отдельности.
Ключевые слова: почвенная структура, система землепользования, метагеном, 16S рРНК, пиросе-квенирование, биоразнообразие.
DOI: 10.7868/S0032180X15110088
ВВЕДЕНИЕ
Связь почвенной структуры, органического вещества и микроорганизмов отмечали многие исследователи [31, 32, 35]. Наличие в почве агрегатов различного размера определяет существование в ней микрозональности как следствия неравномерности поступления органических остатков и корневых экссудатов, различий в распределении физико-химических условий и минералогического состава, разной величины окислительно-восстановительного потенциала на внешней и внутренней поверхностях структурных отдельностей. Таким образом, посредством формирования различ-
* Работа выполнена при финансовой поддержке Российского Научного фонда. Работы по сбору образцов и агрохимическому анализу почв осуществлялись за счет средств гранта РНФ № 14-26-00079 (сотрудники ФГБНУ Почвенного института им. В.В. Докучаева: О.В. Кутовая, А.К. Тхакахова, Б.М. Когут, Т.И. Чернов), пиросеквенирование и анализ данных были проведены за счет финансовой поддержки гранта РНФ 14-26-00094 (сотрудники ФГБНУ ВНИИСХМ Е.А. Иванова, Е.В. Першина, Е.Е. Андронов).
ных макро-, мезо- и микросред, в каждой из которых создаются разные и часто прямо противоположные условия для развития отдельных групп микроорганизмов, почвенные агрегаты различного размера оказывают существенное влияние на таксономический состав и определяют функциональное состояние микробиома в целом.
Согласно концептуальной модели иерархии агрегатов, микроорганизмы принимают активное участие в формировании и поддержании агрегатной структуры почвы [17, 22, 29, 31]. Элементарные минеральные частицы связываются с органическим веществом бактериального или грибного происхождения, а также полисахаридами растительного происхождения и растительными остатками, что приводит к формированию микроагрегатов, которые, взаимодействуя друг с другом, образуют макроагрегаты [7]. Гидрофобность выделяемых микроорганизмами внеклеточных полисахаридов увеличивает устойчивость почвенных агрегатов [6].
Традиционно изучение микробных сообществ почвенных агрегатов проводилось преимущественно с использованием классических микробиологических методов — культуральных посевов на питательные среды, а также определения дыхания и микробной биомассы [2, 9]. Однако на сегодняшний день существуют моле-кулярно-экологические исследования, посвященные изучению таксономического разнообразия микробного сообщества в агрегатах различного размера [6, 14, 30], а также внутри и на поверхности почвенных агрегатов [27]. Показана приуроченность микроорганизмов в большей степени к более тонким гранулометрическим фракциям почвенных частиц. Отмечена отрицательная корреляция микробного обилия с увеличением порового пространства внутри агрегата и между соседними агрегатами [13]. Согласно данным пиросеквенирования, показано, что макроагрегаты (>250 мкм), характеризующиеся высокими уровнями содержания доступного углерода и азота, содержат в основном бактерий, принадлежащих к филам Actinobacteria, Bacteroidetes, Verucomicrobia и 8-Pmteobacteria. В микроагрегатах (53—250 мкм) доминировали бактерии из групп Rubrobacteriales и Chloroflexi [14, 27, 28, 30].
Важно отметить, что в вышеупомянутых работах практически отсутствуют данные о закономерности в распределении микроорганизмов в макроагрегатах размером >2 мм, количество которых оказывает существенное влияние на водно-физические свойства почв и соотносится с понятием агрономически ценной структуры [3]. При этом мало данных о связи таксономического состава микробиома с агрегатной структурой почвенного матрикса в различных агроэко-логических условиях. Выявление микробиологических индикаторов таких процессов, как почвоутомление, ухудшение структуры, а также восстановление почвы, и создание специализированной базы данных на основе микробиологического мониторинга почв сельскохозяйственного назначения может служить основой для формирования системы управления почвенным качеством и оптимизации землепользования.
В связи с этим целью настоящего исследования был анализ состава и структуры микробиома различных агрегатных фракций чернозема типичного в контрастных ("экстремальных") условиях землепользования.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ
Образцы почв отбирали из пахотного горизонта (0—25 см) типичного чернозема в условиях длительного стационарного опыта на территории Петринского опорного пункта Почвенного института им. В.В. Докучаева и Курского НИИ АПП (Курская обл.). Для целей анализа почвенного
микробиома были отобраны пробы почв из трех контрастных вариантов опыта: 1 — бессменная озимая пшеница с 1964 г., 2 — бессменный пар с 1964 г. (до 1964 г. — 200-летняя пашня) и 3 — участок бессменного пара, отведенный с 1998 г. под залежь и в настоящее время занятый целинной разнотравно-луговой степной растительностью.
Из каждого варианта опыта отбирали 3 монолитных образца естественного сложения размером 25 х 25 х 25 см. С учетом того, что высушивание почвы зачастую дает искаженные, как правило, заниженные результаты численности микроорганизмов (количество бактерий уменьшается в 5— 10 раз) и при этом меняется качественный состав микроорганизмов [4], рассев на агрегаты производили из свежих образцов естественной влажности. Почва была рассеяна на ситах: 0.25; 0.5; 1; 2; 3; 5; 7 мм, предварительно стерилизованных 70%-ным этиловым спиртом.
Для анализа структурных особенностей микробного сообщества были рассмотрены контрастные агрегатные фракции — <0.25, 2—5 и более крупные структурные отдельности >7 мм в диаметре.
Определение содержания органического углерода и азота в почвенных пробах проведено методом сухого сжигания на автоматическом макро-элементном C/N-анализаторе Vario MICRO Cube (Elementar, Германия).
ДНК выделяли из 0.2 г почвы после механического разрушения с использованием стеклянных шариков в экстрагирующем буфере: 350 мкл раствора А (натрий-фосфатный буфер — 200 мМ; изотиоцианат гуанидина — 240 мМ; pH 7.0), 350 мкл раствора Б (Трис-HCl - 500 мМ; SDS -1% по массе к объему; pH 7.0) и 400 мкл смеси фенола с хлороформом (1 : 1). Разрушение образца проводили в течение 40 с при максимальной мощности (скорость 6500 об./мин. — 680 рад./с) с использованием 3D-вращения на гомогенизаторе Precellys 24 (Bertin Technologies, Франция). Полученный препарат центрифугировали при максимальной скорости 16000 об./мин (1700 рад./с) в течение 5 мин. Водную фазу отбирали и повторно экстрагировали хлороформом. ДНК осаждали, добавляя равный объем изопропилового спирта. После центрифугирования осадок промывали 70% этанолом и растворяли в воде при 65°С в течение 5—10 мин. Очистку ДНК проводили с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле с последующим выделением ДНК из геля методом сорбции на оксиде кремния [1].
Количественный учет бактериального, архейного и грибного компонентов в микробиомах исследуемых образцов проводили с использованием количественной полимеразно-цепной реакции (ПЦР) с детекцией в реальном времени. В качестве контроля для
бактерий использовали клонированные фрагменты рибосомального оперона Escherichia coli (Sigma), для архей — штамма FG-07 Halobacterium salinarum [23] для грибов — штамма дрожжей Sac-charomyces cerevisiae Meyen 1B-D1606 [26].
Для проведения амплификации использовалась смесь SsoFast™ EvaGreen® Supermix (термический профиль: 95°С - 10 с, 50°С - 10 с, 72°С -20 с; всего 40 циклов). Были использованы следующие праймеры: Eub338/Eub518 — для бактерий [24], arc915f/arc1059r - для архей [36], ITS1f/5.8s -для грибов [19]. Количественные оценки приводились к числу рРНК оперонов на грамм почвы. ПЦР с детекцией в реальном времени проводили в амплификаторе CFX96 Touch (BioRad). Определение для каждого образца проводили в трех по-вторностях. Обработку результатов количественной ПЦР проводили с использованием программного обеспечения, прилагающегося к прибору CFX96 Touch.
На основании результатов количественной ПЦР, выраженной в количестве копий оперона рРНК на грамм почвы, проводились оценки бактериальной, архейной (количество клеток) и грибной биомассы. Данный параметр используется как правило для анализа относительных количеств микроорганизмов в различных почвах,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.