БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 8, с. 1186 - 1194
УДК (616.12+616-002.1):612.273.2
СТРУКТУРНО-ДИНАМИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ В МИТОХОНДРИЯХ МИОКАРДА КРЫС ПРИ ОСТРОЙ ГИПОКСИЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ: РОЛЬ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО АТФ-ЗАВИСИМОГО КАЛИЕВОГО КАНАЛА*
© 2015 Е.В. Розова1, И.Н. Маньковская1, Г.Д. Миронова2 3**
1 Институт физиологии им. А.А. Богомольца НАН Украины, Украина, 01024 Киев; факс: +7(380-044)256-2000, электронная почта: erozova@ukr.net 2 Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290 Пущино Московской обл.; факс: +7(4967)33-0553, электронная почта: mironova40@mail.ru
3 Пущинский государственный естественно-научный институт, 142290 Пущино Московской обл.
Поступила в редакцию 01.07.14 После доработки 09.02.15
Исследованы изменения ультраструктуры и пространственной локализации митохондрий в миокарде при 30-мин гипоксической гипоксии. В этих условиях митохондрии изменяют свою структуру, однако выраженных некротических повреждений в них не обнаружено. При этом в миокарде появляются изменения, направленные на усиление энергетических процессов. Это выражается в увеличении количества митохондрий (МХ) в субсарколеммальной зоне гипоксического миокарда с изменением поверхности сублемальной мембраны в виде ее изгибов вокруг митохондрий, что улучшает условия диффузии кислорода к митохондриям благодаря возрастанию площади диффузии. Усиливается также деление МХ, что способствует увеличению их количества. В структурно измененных митохондриях обнаруживаются небольшого диаметра электронно-плотные образования, представляющие собой вновь образующиеся органеллы — микроМХ — на различных стадиях структурной организации, что не наблюдается в миокарде при нормоксии. Выявлено, что одним из регуляторов морфологического состояния МХ при гипоксической гипоксии является АТФ-зависимый калиевый канал: активатор канала увеличивает количество вновь образованных микроМХ, а ингибитор предотвращает их образование. Обсуждаются возможные механизмы появления структурно-динамических изменений в митохондриальном аппарате миокарда крыс при острой гипоксической гипоксии.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: митохондрия, гипоксическая гипоксия, ультраструктура, пространственная локали-
Изменения функционирования клеток при различных физиологических и патологических состояниях приводят к формированию в организме адаптивно-приспособительных или патологических реакций в ответ на эндо- и экзоген-
Принятые сокращения: Г — острая гипоксическая гипоксия; МХ — митохондрии; 5HD — 5-гидроксидеканоат; ИМФ МХ — интрамиофибриллярная субпопуляция МХ; микроМХ — микромитохондрии; митоКАТР — митохондри-альные ATP-зависимые К+-каналы; СС МХ — субсарко-леммаль субпопуляция МХ; Si tot — сумма поверхностей МХ в единице объема ткани.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 14-188, 12.04.2015.
** Адресат для корреспонденции.
ные воздействия. Главным патогенетическим звеном при кислородном голодании тканей в организме является повреждение митохондрий (МХ), сопровождающееся нарушениями энергообеспечения и антиоксидантной защиты, а также стабильности мембран вследствие интенсификации образования продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) [1—6]. Экспериментальные исследования, проводимые в условиях гипоксии, позволили сделать вывод о том, что одними из первых органелл повреждаются МХ, являющиеся наиболее чувствительными к неблагоприятным воздействиям [7, 8]. МХ относятся к постоянно обновляющимся структурам клетки. Для нормального функционирования в условиях гипоксии МХ большое значение при-
обретает их внутриклеточное распределение, определяемое взаимодействием со структурами цитоскелета [9—11].
Локализация МХ в клетке находится под контролем внешних и внутренних факторов и может изменяться при транспорте этих органелл вдоль микротрубочек и актиновых филаментов с помощью моторных белков [8—15]. В клетке МХ формируют высокодинамичный ретикулум, в котором происходят процессы постоянного ремо-делирования. Качество МХ в тканях контролируется установлением баланса между удалением поврежденных МХ путем митофагии и генерацией новых полноценных органелл в результате их деления и активации биогенеза [7, 8, 11]. Окислительный стресс является, по литературным данным, одним из факторов, индуцирующих изменения динамического равновесия в митохонд-риальном аппарате клеток [4, 5, 13]. Изменения динамики МХ при продолжительном стрессе и острой тяжелой гипоксии различного генеза приводят к развитию митохондриальной дисфункции: снижается максимальная скорость дыхания, АОР-стимулируемое потребление кислорода, существенно снижаются активность креатинкина-зы и уровень цитохрома с. Антиапоптотический белок Вс1-2 перемещается с внутренней мембраны митохондрий к наружной [4, 6, 10].
МХ миокарда имеют определенный характер локализации в клетке, существенный для функционирования такого энергозатратного органа как сердце. При изменении условий существования клетки элементы цитоскелета, обеспечивающие перемещение МХ в участки, где облегчена диффузия О2, подвержены значительным модуляциям [10—12]. Механизм этого явления, наблюдаемого при различных эндо- и экзогенных воздействиях, пока не выяснен, хотя понимание его является важным шагом на пути к выяснению причин изменений энергетического метаболизма при этом.
Нарушения «правильного» распределения и транспорта митохондрий могут приводить к формированию ряда патологических состояний, в частности, к развитию тканевой гипоксии. При этом, одним из наиболее постоянных проявлений повреждения клеток при различных неблагоприятных воздействиях, включая недостаток кислорода, возникающий по разным причинам, является увеличение объема митохондрий — набухание. Помимо этого, МХ в экстремальных состояниях способны расти и делиться, достигать гигантских размеров, иногда больших, чем ядро, образуя мегамитохондрии [6—8, 16-17].
Недавно была выявлена специфическая форма изменений МХ кардиомиоцитов в усло-
виях in vitro при длительной (в течение 6—72 ч при температуре 20°) инкубации кусочков сердца в среде, лишенной О2 [16]. При этом в структурно поврежденных органеллах выявляются микроМХ диаметром до 0,15 мкм [18, 19].
Показано, что образующиеся микроМХ полностью либо частично наследуют функции «родительских» митохондрий: в них, например, выявлен адекватный для нормальных МХ уровень активности цитохрома с [18]. Исследователи рассматривают данный процесс, как один из путей апоптотических изменений в МХ, что позволяет считать апоптоз двуединым процессом «саморазрушения-самосозидания» [18—21]. При этом механизмы, ответственные за подобные изменения ультраструктуры МХ, остаются невыясненными.
Известно, что митохондриальный АТР-зави-симый калиевый канал (митоКАТР) участвует в защите сердца при ишемии, а также в процессах адаптации организма к гипоксии, и активаторы этого канала обладают кардиопротекторным действием [22—24]. Существование этого канала в митохондриях у многих исследователей не вызывает сомнения [см. обзоры 25, 26]. Однако, отсутствие достоверных данных о структуре канала не позволяло полностью быть уверенным в этом [27]. В последнее время появились работы об идентификации структуры митоКАТР канала. Установлено, что она близка к структуре цито-плазматического АТР-зависимого калиевого канала почек, так называемого ROMK (renal outer medullary potassium channel) канала, относящегося к семейству KIR (potassium inward rectified) каналов [28]. Кроме того, с помощью иммуно-химического анализа с использованием электронной микроскопии доказана локализация KIR каналов в митохондриях [29].
В связи с вышесказанным, целью настоящей работы было изучение изменений пространственного расположения и ультраструктуры митохондрий в кардиомиоцитах при воздействии на животных in vivo острой 30-мин гипоксичес-кой гипоксии. Установлено, что такая гипоксия способствует появлению изменений в ультраструктуре митохондрий, направленных на усиление энергетических процессов, т.е. на адаптацию животных. Показано, что митоКАТР канал участвует в формировании этих изменений в структуре МХ.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Реагенты. Глютаровый альдегид, уранилаце-тат, цитрат свинца — все реактивы фирмы «Sigma» (США); эпон-аралдит — фирма «Fluka»
(Швейцария); diazoxide и 5-гидроксидеканоат (5HD) - фирма «Schering AG» (США).
Исследование проведено на 34 половозрелых белых лабораторных крысах-самцах линии Wistar массой 220-300 г. Контрольная группа животных составляла 8 особей.
Гипоксическую гипоксию создавали в герметичной камере объемом 10 л с находящимся в ней животным с помощью газовой смеси, содержащей 7% кислорода в азоте, с поглощением выделяемого крысами СО2 прокаленной натронной известью. Животные находились в камере в течение 30 мин. Достигаемое при этом снижение концентрации кислорода во вдыхаемом животным воздухе дало возможность определить границы приспособительных возможностей организма на тканевом и клеточном уровнях [30].
С целью изменения активности митоКАТР, активаторы которого обладают кардиопротек-торными свойствами [31], животным за 1 ч до начала воздействия внутривенно вводили селективный активатор митоКАТФ — диазоксид в дозе 0,3 мг/100 г массы тела) либо селективный ингибитор митоКАТР — 5-гидроксидеканоат (5HD) в дозе 0,5 мг/100 г массы тела [31]. Образцы ткани для электронно-микроскопических исследований отбирали через 90 мин после введения препаратов и через 30 мин после начала гипоксии.
После окончания гипоксической экспозиции крыс под слабым эфирным наркозом дека-питировали, затем забирали кусочки ткани из верхушки сердца. Фиксацию материала производили немедленно 2,5%-ным раствором глюта-рового альдегида в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,4. Далее материал дополнительно фиксировали с помощью реактива Колфилда (на основе 2%-ного раствора OsO4, в 0,1 М фосфатном буфере — рН 7,4). Обезвоживание материала производили в спиртах возрастающей концентрации, абсолютном спирте и ацетоне c последующей заливкой в эпон-аралдит, которая осуществлялась по общепринятой методике [32].
Ультратонкие срезы толщиной 40—60
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.