РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2008, том 48, № 6, с. 734-740
-- УФ-ИЗЛУЧЕНИЕ
УДК 612.111.11:535-31
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ МОЛЕКУЛ ГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА, ИНДУЦИРОВАННЫЕ ВАКУУМНЫМ УЛЬТРАФИОЛЕТОВЫМ СВЕТОМ
© 2008 г. В. Г. Артшхов*, А. А. Пантявин
Воронежский государственный университет
Целью настоящей работы явилось изучение закономерностей действия вакуумного ультрафиолетового излучения на структурно-функциональное состояние молекул некоторых транспортных белков крови в условиях различного микроокружения. В работе использовали тонкие пленки толщиной 0.1-0.5 мкм и растворы гемоглобина человека в концентрациях 5 х 10-6-10-5 моль/л. Облучение полученных образцов белка проводили с применением специально созданной для этих целей установки, включающей в качестве источника вакуумного УФ-излучения лампы барьерного разряда в инертных газах (криптоне, ксеноне и аргоне). Методами спектрофотометрии и регистрации кривых диссоциации оксигемоглобина изучены структурно-функциональные модификации молекул гемоглобина, индуцированные воздействием вакуумного УФ-света (118-187 нм) в дозах (0.672) кДж/м2. Показано, что при использовании энергетической экспозиции 600 Дж/м2 наблюдается достоверное снижение интенсивностей полос поглощения 413 нм к 405 нм, а также увеличение соотношения интенсивностей полос поглощения при 500 нм к 542 нм, что указывает на накопление в изучаемой системе окисленной формы гембелка. Это увеличение сопровождается снижением интенсивностей полос поглощения при 542 нм к 560 нм, что свидетельствует в пользу представлений об изменении внутримолекулярной структуры гемоглобина. В то же время при облучении молекул гембелка в дозе 6 кДж/м2 регистрируется уменьшение величины полунасыщения гемоглобина кислородом (величина Р50) до 14.2 ± 1.1 мм рт. ст. по сравнению с контролем (необлученный образец белка), что указывает на увеличение сродства гемоглобина к кислороду. Таким образом, вакуумное ультрафиолетовое излучение в области светопоглощения хромофоров пептидных связей и карбоксильных групп белковых молекул индуцирует нарушения высших типов их пространственной организации, что приводит к изменению функциональных свойств макромолекул гемоглобина.
Гемоглобин человека, вакуумное ультрафиолетовое излучение, хромофоры, карбоксильная группа, пептидная группа, фотоионизация, спектр поглощения, лампа барьерного разряда, энергетическая экспозиция, кривая диссоциации оксигемоглобина.
Ультрафиолетовый свет является постоянно действующим экологическим фактором, под влиянием которого находятся все живые системы на Земле. В период биохимической эволюции поверхность Земли из-за отсутствия озонового пояса была подвержена действию всего спектра УФ-излучения Солнца, что создавало большие возможности для абиогенного синтеза органических соединений. Исследование фотопроцессов, происходящих в белках и их компонентах под влиянием вакуумного УФ-излучения (ВУФ, X < 200 нм), имеет важное значение для выяснения физико-химических основ его биологического действия, так как эта область электромагнитного спектра Солнца является пограничной между неионизиру-ющими и ионизирующими излучениями.
*Адресат для корреспонденции: 394006 Воронеж, Университетская пл., 1, Воронежский гос. ун-т, биолого-почвенный фак-т, каф. биофизики и биотехнологии; тел.: (4732) 2085-86; факс: (4732) 20-83-08; e-mail: avg@main.vsu.ru.
Большинство работ, посвященных биологическому действию вакуумного ультрафиолета на молекулярном уровне, выполнено с использованием в качестве объектов исследования нуклеиновых кислот и их компонентов [1-6]. Особенностям взаимодействия ВУФ-излучения с белковыми системами уделено гораздо меньшее внимание со стороны исследователей. В литературе практически не обсуждался вопрос о взаимосвязи до-зозависимых структурных перестроек молекул белка с изменением их функциональной активности после ВУФ-облучения, не определено соотношение вкладов тех или иных фотохимических процессов в эффектах ВУФ-модификации белковых макромолекул. Поэтому анализ экспериментальных данных, касающихся фотохимических изменений белковых молекул, индуцированных вакуумным ультрафиолетовым излучением, позволит наметить некоторые модельные подходы к установлению возможных путей эволюции структуры этих биологически важных молекул и выяс-
нить особенности проявления белками своих функциональных свойств в условиях различного микроокружения.
Фотохимические процессы, происходящие в белках и их компонентах под действием УФ-света в спектральной области 200-400 нм, изучались многими авторами [7-10]. В вакуумной УФ-обла-сти спектра с X < 200 нм эти процессы практически не исследованы. Действие УФ- и вУФ-излу-чения на белковые системы может различаться первичными фотофизическими процессами, что может привести к образованию неодинаковых конечных фотопродуктов и к инактивации белковых молекул [11].
Исходя из вышеизложенного, нами проведены систематические исследования структурно-функциональных фотомодификаций гемоглобина под влиянием вакуумного УФ-света. Это обусловлено его значительным содержанием среди всех белковых компонентов крови, известной структурной организацией молекул и важностью функции, которую выполняет этот белок, - транспорта различных низкомолекулярных лигандов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
В опытах применяли растворы оксигемогло-бина человека в концентрациях 10-5-10-4 моль/л в бидистиллированной воде, который выделяли по методу, описанному Б.Ь. БгаЪкт [12] с модификациями Л.А. Блюменфельда [13]. В основе этого метода лежит явление гемолиза эритроцитов под действием воды.
Пленки гембелка получали высушиванием нейтральных водных растворов в концентрациях 5 х 10-6-10-5 моль/л в объеме 10 мкл на подложках М§Б2 (диаметр 30 мм, толщина 1 мм). Толщина пленок белка, измеренная при помощи интерференционного микроскопа МИИ-4 ("ЛОМО", Россия), составляла 0.1-0.5 мкм.
Облучение молекул гемоглобина проводили светом ламп барьерного разряда в инертных газах (аргоне, криптоне, ксеноне) в диапазоне длин волн 118-187 нм [14] с помощью установки, собранной на кафедре биофизики и биотехнологии Воронежского госуниверситета [15]. Поток излучения разряда в газах, падающий на образец, составлял 10 Вт/м2.
Измерение спектров поглощения пленок белка проводили на спектрофотометре СФ-46 в области длин волн 183-750 нм через 1 нм. Подложку М§Б2 с нанесенным на нее образцом помещали в спектрофотометрическую ячейку, которая находилась в кюветном отделении прибора. Контролем служила подложка М§Б2 без образца. Интенсивность поглощения света в пленках гемоглобина измеряли в длинноволновой области спектра 500-630 нм, которая использовалась для оценки
Таблица 1. Соотношение интенсивностей полос поглощения гемоглобина
Доза облучения, кДж/м2 500/542 542/560
0 0.67 ± 0.03 1.23 ± 0.01
6 0.76 ± 0.03 1.17 ± 0.02
12 0.80 ± 0.01 1.12 ± 0.04
18 0.80 ± 0.03 1.10 ± 0.02
24 0.81 ± 0.06 1.09 ± 0.03
72 0.81 ± 0.05 1.04 ± 0.02
радиационного повреждения гемоглобина в работе [16].
Регистрацию кривых диссоциации оксигемо-глобина (КДО) осуществляли спектрофотомет-рически [17] на специально созданной на кафедре биофизики и биотехнологии Воронежского госуниверситета установке [18].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Нами установлено, что после облучения светом ксеноновой лампы КсБФ-10 (Хтах = 172 нм) в дозах 6-100 кДж/м2 не происходит статистически достоверного изменения соотношения интенсивности полос поглощения для оксигемоглобина (412-414 нм) и метгемоглобина (405 нм) по сравнению с контролем (необлученная пленка белка). Это связано, по-видимому, с устойчивостью оксигемоглобина к действию радиации, не превышающей пороговый потенциал ионизации белковой молекулы [19].
Показано, что при использовании энергетической экспозиции криптоновой лампы КрБФ-10 (Хтах = 146 нм) 6 кДж/м2 наблюдается уменьшение светопоглощения гембелка при 576 нм (рис. 1). Это уменьшение сопровождается снижением соотношения интенсивностей полос поглощения 542 нм к 560 нм, что свидетельствует в пользу представлений об изменении внутримолекулярной структуры гемоглобина (табл. 1).
В то же время облучение гемоглобина в дозе 6 кДж/м2 приводит к повышению светопоглощения при 630 нм, что свидетельствует о накоплении в изучаемом образце метформы гемопротеида. Дозовая кривая образования данного фотопродукта при ВУФ-облучении пленок белка показана на рис. 2. Дальнейшее увеличение дозы облучения до 72 кДж/м2 не приводит к статистически достоверному изменению соотношения полос поглощения при 500 и 542 нм.
Расчет константы скорости ВУФ-превраще-ния молекул гембелка (К проводили по формуле: К = (2.303/?) ^ (В0/В), где I - время облучения, мин; В0 - оптическая плотность пленок оксигемо-
В 0.22
0.19-
0.16-
0.13
20
40
60 80 Доза, кДж/м2
0
Рис. 2. Дозовая кривая увеличения оптической плотности молекул гемоглобина в пленке при 630 нм.
0.24
0 20 40 60 80
Доза, кДж/м2
Рис. 1. Дозовая кривая уменьшения оптической плотности молекул гемоглобина в пленке при 576 нм.
глобина при 576 нм до облучения; Б - оптическая плотность образцов белка при 576 нм после воздействия ВУФ-лучей в области 131-161 нм (табл. 2).
В спектрах поглощения гемоглобина после облучения его тонких пленок светом криптоновой лампы в интервале доз 72-600 кДж/м2 происходит сдвиг полосы Соре в коротковолновую область спектра, что наряду с максимумом при 630 нм свидетельствует о переходе гемоглобина в метформу. Поскольку в метгемоглобине связь гемина с глобином осуществляется только через его -СООН группы, мы предприняли попытку блокировать эти группы раствором гидроксида натрия. После облучения тонкой пленки оксигемоглобина в до-
зе 400 кДж/м2 ее переводили в раствор с использованием 0.01 н натрий-фосфатного буфера (рН 7.4) и добавляли 1 мл 0.1 н раствора КаОИ, после чего на спектрофотометре СФ-46 снимали спектр поглощения полученного раствора. Последний характеризовался диффузной полосой поглощения низкой интенсивности с максимумом при 390 нм (рис. 3). Это указывает на наличие в растворе свободного гематина, т.е. на разрыв связей гемин-глобин при использовании указанной энергетической э
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.