РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2008, том 48, № 6, с. 741-747
-- УФ-ИЗЛУЧЕНИЕ
УДК 599.9:612.112.94:535-31
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ МОДИФИКАЦИИ ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА, ИНДУЦИРОВАННЫЕ ВОЗДЕЙСТВИЕМ УФ-СВЕТА
© 2008 г. В. Г. Артшхов1*, М. А. Наквасина1, Л. И. Попова2, М. С. Трубицына1,
О. В. Лидохова1, Л. С. Свекло3
1 Воронежский государственный университет 2 Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н. Бурденко 3 Воронежская областная станция переливания крови
Исследовано влияние УФ-света (240-390 нм) в дозах 75.5-1510 Дж/м2 на структурно-функциональные свойства (цитотоксическую активность, антителопродуцирующую способность, уровень экспрессии поверхностных рецепторов, уровень цАМФ) лимфоцитов периферической крови доноров. Обнаружено корригирующее действие УФ-излучения на цитотоксическую активность лимфоцитов по отношению к клеткам асцитной карциномы Эрлиха. Установлена взаимосвязь типов модификаций компонентов плазматической мембраны с уровнем функциональной активности лимфоцитов. Показано, что УФ-свет индуцирует снижение уровня вторичного мессенджера цАМФ в цитозоле фотомодифицированных клеток. Выявлено, что УФ-излучение вызывает стимулирование антите-лонезависимого механизма цитотоксичности лимфоцитов, связанного с активацией T-клеток, и ин-гибирование антителозависимого механизма цитотоксической активности.
Лимфоциты, УФ-свет, уровень экспрессии, цитотоксичность, цАМФ.
До настоящего времени остаются малоисследованными многие аспекты проблемы изучения физико-химических основ лечебного действия фотомодифицированной крови [1]. Одним из подходов для раскрытия "тонких" механизмов положительного влияния на организм человека метода аутотрансфузии УФ-облученной крови (АУФОК), эффективность которого во многих случаях не уступает традиционным способам фармакотерапии, является детальное изучение фотохимических превращений отдельных компонентов и систем эритроцитарных и лейкоцитарных клеток. УФ-свет способен изменять экспрессию функционально важных молекул на поверхности клеток иммунной системы и оказывать влияние на ключевые события иммунного ответа [2-4]. В этой связи перспективным представляется использование УФ-излучения с целью разработки методов стимулирования и активации компонентов иммунной системы и оценка возможности применения активированных иммуноцитов в иммунотерапии. Однако появление сообщений о повреждающем действии УФ-излучения на клеточные элементы крови, неидентичность условий облучения крови вне организма и в клинике породили в известной мере неоднозначное отношение к данному мето-
*Адресат для корреспонденции: 394006 Воронеж, Университетская пл., 1, ГОУ ВПО ВГУ; тел.: (4732) 20-89-81, (4732) 20-85-86; факс: (4732) 20-83-08; e-mail: avg@main.vsu.ru.
ду. Эти обстоятельства требуют интенсификации исследований, касающихся изучения молекуляр-но-клеточных механизмов реализации организ-менных эффектов АУФОК.
Все изложенное выше диктует необходимость проведения исследований, направленных на выявление возможного модулирующего действия УФ-излучения на структурно-функциональные свойства лимфоцитарных клеток человека, что позволит приблизиться к пониманию механизмов регулирования функций компонентов иммунной системы и разработать методы направленной коррекции состояния иммунитета в условиях патологии.
Исходя из этих соображений, в данной статье приводятся результаты изучения изменений цитотоксической активности, антителопродуциру-ющей способности, уровня экспрессии поверхностных рецепторов, уровня цАМФ лимфоцитов крови человека после воздействия УФ-света (240-390 нм) в дозах 75.5-1510 Дж/м2.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Выделение лимфоцитов из периферической крови доноров осуществляли путем ее центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урогра-фина (р = 1.077 г/см3). Разделение суспензии лим-
дцт, %
10 г
5 0
-5 -10 -15 -20 -25 10 8
6
4 2 0
-2 -4 -6 20 15 10
5 0
-5 -10
и-
75.5 151 755 1510
0 75.5 151 755 1510
п п п
0 75.5 151 755 1510 Доза УФ-облучения, Дж/м2
Рис. 1. Изменения уровня цитотоксической активности (А ЦТ) лимфоцитов человека по отношению к клеткам асцитной карциномы Эрлиха после облучения УФ-светом: а - первый тип реагирования клеток; б - второй тип реагирования клеток; в - третий тип реагирования клеток.
фоцитов на T- и B-клетки проводили на колонках с синтетической ватой по методу P. Terasaki [5].
Цитотоксическую активность лимфоцитов по отношению к клеткам асцитной карциномы Эрлиха, культивируемой в организме лабораторных мышей линии SHK, определяли при помощи колориметрического МТТ-анализа [6]. Для оценки антителообразующей способности лимфоцитов использовали метод локального гемолиза [7]. Жизнеспособность лимфоцитов определяли по стандартной методике с использованием трипа-нового голубого [8].
Для изучения уровня Fc-рецепторов, CD56-, CD19-, CD3-, CD8-, CD56-маркеров на поверхности нативных и модифицированных лимфоцитов применяли метод иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием соответственно антисыворотки против IgG, моноклональных антител, конъюгата к ним - козьих антител против IgG мыши, меченных пероксидазой хрена ("Сорбент", Москва) [9].
Уровень цАМФ в цитозоле лимфоцитов до и после УФ-облучения определяли радиоиммунным методом [10].
УФ-облучение исследуемых образцов проводили при их непрерывном перемешивании магнитной мешалкой в термостатируемой кювете (20 ± 1°С) с помощью ртутно-кварцевой лампы типа ДРТ-400 через светофильтр УФС-1 с полосой пропускания 240-390 нм. Интенсивность облучения составляла 151 Дж/м2 в 1 мин.
Статистическую обработку результатов экспериментов проводили с помощью пакета статистических программ "81а!§гарЫсз". Достоверность различий контрольных и экспериментальных результатов оценивали при помощи ¿-критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Анализ результатов исследования уровня цитотоксической активности интактных и фотомо-дифицированных лимфоцитов периферической крови человека позволил выделить три типа ответных реакций клеток на воздействие УФ-света в диапазоне доз 75.5-1510 Дж/м2.
Первый тип реагирования лимфоцитов на облучение характеризовался изначально высоким уровнем цитотоксичности - 94.7 ± 0.9%. После УФ-облучения в дозах 75.5, 151, 755 и 1510 Дж/м2 для него наблюдалось статистически достоверное снижение величины изучаемого показателя соответственно на 9, 14, 12 и 18% по отношению к уровню контрольного образца (рис. 1, а). Второй тип клеток со средними показателями цитотоксичности - 85.3 ± 1.5% - отличался иным характером зависимости тестируемого параметра от дозы УФ-света (рис. 1, б). Облучение в дозах 75.5 и 151 Дж/м2 индуцировало статистически достоверное повышение активности лимфоцитов по сравнению с нативным образцом. При воздействии УФ-излучения в дозах 755 и 1510 Дж/м2 наблюдалось снижение цитотоксичности клеток до контрольного уровня (величины изучаемого параметра статистически достоверно не отличаются от контрольных значений). Для третьего типа клеток с изначально низкой активностью - 66.0 ± ± 4.6% - выявлено статистически достоверное повышение уровня цитотоксичности лимфоцитов по отношению к таковому для контрольного образца во всем использованном диапазоне доз облучения (рис. 1, в).
Суммируя полученные результаты, можно заключить, что УФ-свет индуцирует снижение уровня цитотоксической активности лимфоцитов с более высокими исходными показателями и повышение такового для лимфоцитов с более низкими величинами активности. Следовательно, можно говорить о корригирующем действии УФ-излучения на цитотоксическую активность
лимфоцитов по отношению к клеткам асцитной карциномы Эрлиха. Обращает на себя внимание тот факт, что при малых дозах облучения (75.5 и 151 Дж/м2) наблюдается повышение уровня активности лимфоцитов доноров со средними и низкими показателями цитотоксичности. Эти результаты свидетельствуют в пользу представлений о стимулирующем действии "терапевтических" доз УФ-света на компоненты иммунной системы организма человека.
Реализация цитотоксической активности лимфоцитов в условиях in vitro связана с T-лимфоцит-зависимым антителонезависимым и антителоза-висимым механизмами [11]. С целью выявления вклада каждого из вышеназванных механизмов в реализацию общей цитотоксической активности лимфоцитов представлялось необходимым исследовать активность T-клеточных суспензий по отношению к опухолевым клеткам.
Нами установлено, что динамика УФ-индуци-рованных изменений цитотоксической активности смеси лимфоцитов и T-клеточной суспензии (содержание T-лимфоцитов 87 ± 3%) в целом совпадает, хотя в случае использования смеси клеток обнаруженные эффекты проявляются более ярко. Это, вероятно, указывает на возможность участия в реализации механизма цитотоксичности в условиях облучения не только T-, но и B-клеток, и натуральных киллеров (NK), а также, возможно, и растворимых медиаторов, синтезируемых иммунокомпетентными клетками, в частности, фактора некроза опухолей, интерлейкинов (ИЛ) 1 и 2, интерферонов.
При исследовании влияния УФ-света (240390 нм) в диапазоне доз 75.5-2265 Дж/м2 на уровень продукции фактора некроза опухолей T-лимфоцитами человека было обнаружено [12], что УФ-свет оказывает модулирующее действие на величину изучаемого параметра, причем конечный эффект зависит от исходной концентрации цитокина. Облучение в дозах 75.5 и 2265 Дж/м2 лимфоцитов доноров с исходно низкой концентрацией ФНО-а (28.9 ± 5.0 пкг/мл) индуцирует повышение уровня продукции цитокина соответственно в 3.4 и 6.7 раза. Воздействие УФ-света в дозах 75.52265 Дж/м2 на лимфоциты доноров, у которых выявлены более высокие исходные величины содержания ФНО-а (превышающие средние значения), вызывает снижение уровня продукции цито-кина.
Выявлено [13], что при УФ-облучении лейкоцитов донорской крови изменяется уровень синтезируемых ими цитокинов: продукция ИЛ-1Р и ИЛ-2 возрастает на 94 и 10% соответственно.
Таким образом, полученные нами экспериментальные данные по изучению фотоиндуцирован-ных изменений цитотоксической активности лимфоцитов коррелируют с результатами исследова-
ния уровня продукции цитокинов иммуноцитами, уч
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.