ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 2, с. 175-183
УДК 581.1
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ МУТАНТНЫХ ПЛАСТИД ВНЕЯДЕРНЫХ ПЕСТРОЛИСТНЫХ
ФОРМ ПОДСОЛНЕЧНИКА
© 2004 г. А. В. Усатов, В. В. Рассадина*, Н. Г. Аверина*, Л. А. Лежнева*, Ю. С. Дудко*, Е. В. Машкина, Э. Я. Прихоженко, Н. С. Колоколова
Научно-исследовательский институт биологии при Ростовском госуниверситете, Ростов-на-Дону * Институт фотобиологии Национальной академии наук Белоруссии, Минск Поступила в редакцию 25.03.2003 г.
Электронно-микроскопический анализ внеядерных пестролистных форм подсолнечника показал, что в пластидах из белых участков листа внутренние мембранные структуры практически отсутствуют. Приведены сравнительные данные количества хлорофиллов (Хл), каротиноидов, содержания 70S рибосом, активности рибулозо-1,5-бифосфаткарбоксилазы у мутантов и исходной зеленой линии. На примере мутанта линии var10 показано, что первыми характерными признаками дефицита Хл является синхронное снижение активности синтеза специфического предшественника Хл - молекул 5-аминолевулиновой кислоты, более низкое по сравнению с контрольной линией соотношение Хл а/b и редукция светимости Хл ФС I. По мере развития у мутанта фотодеструкционных процессов наблюдаемые нарушения усиливаются, приводя к постепенному разрушению комплексов ФС II, а затем и ССК. Признак Хл-дефицитности неустойчив и, в зависимости от условий выращивания растений (разные температурные или световые режимы), либо проявлялся, либо отсутствовал. Свето- и температурозависимость мутантного признака наблюдали только на ранней стадии формирования пигментсодержащих тканей. Прохождение этой стадии в условиях низкой освещенности не только не вызывало недостатка Хл в мутантной ткани, но и блокировало развитие в ней деструктивных процессов при переносе мутанта в условия, способствующие максимальному проявлению пигментной аномалии. Высказано предположение, что исследуемые нами пластомные мутации нарушают регуляцию экспрессии структурных пластогенов, детерминирующих синтез пигментных и белковых компонентов фотосинтетического аппарата, но не вызывают непосредственных изменений в их первичной структуре.
Helianthus annuus - 5-аминолевулиновая кислота - спектры флуоресценции и поглощения листьев -пестролистность - пигмент-белковые комплексы фотосинтетического аппарата - пластомные мутации - протохлорофиллид - хлорофилл
Значительные успехи в изучении механизмов фотосинтеза и особенностей биогенеза фотосинтетического аппарата связаны с исследованиями, проводимыми на мутантных растениях с различными нарушениями состава фотосинтетических мембран [1-5]. Разработанный в НИИБ РГУ метод, основанный на использовании нитрозоме-тилмочевины, дает возможность индуцировать с высокой частотой внеядерные (пластидные) мутации у высших растений [6-8]. Полученные таким способом хлорофильные аномалии у подсолнечника, выраженные в мозаичности или пестро-
Сокращения: АЛК - 5-аминолевулиновая кислота; Пд -протохлорофиллид; Хл - хлорофилл.
Адрес для корреспонденции: Усатов Александр Вячеславович. 344090 Ростов-на-Дону, пр. Стачки, 194/1. НИИ биологии Ростовского госуниверситета. Электронная почта: genlab@bio.rsu.ru
листности растений - variegated forms (var), стали хорошей моделью для изучения роли пластома в осуществлении различных реакций биосинтеза хлорофилла (Хл) и функционировании механизмов, осуществляющих сборку пигмент-белковых комплексов фотосинтетического аппарата [4, 9]. Было показано, что в фенотипически белых листьях мутанта подсолнечника линии var10 с глубоко редуцированным содержанием Хл и резко сниженной активностью начальных и заключительных этапов биосинтеза Хл присутствуют все типы пигмент-белковых комплексов фотосинтетического аппарата, характерные для исходной линии 3629. Однако соотношения между ними были изменены, и в процессе роста и развития таких растений эти нарушения прогрессировали. На этом основании было сделано предположение об усилении в мутантной ткани фотодеструкционных процессов, которые накладываются на события, связанные с проявлением собственно мута-
ции [4]. Высокий уровень фотодеструкционных процессов был действительно отмечен в дефицитной по Хл мутантной ткани пестролистных растений подсолнечника, выращиваемых в полевых условиях. В такой ткани наблюдали высокую активность гидролитических ферментов, усиление автолитических процессов и быструю деградацию клеточных структур по сравнению с нормальными зелеными растениями [10]. Оставалось, однако, неясным, какова природа первичных, связанных с хлорофильной аномалией, признаков пластомной мутации у подсолнечника, степень устойчивости этих признаков, возможность их усиления либо ослабления при изменении условий выращивания растений. С этой целью в работе был изучен ряд структурных и биохимических характеристик му-тантных пластид, прослежен характер изменений в составе фотосинтетического аппарата и активности синтеза его пигментных компонентов в условиях разной интенсивности света и температуры выращивания растений, усиливающих, либо ослабляющих фотодеструкционные процессы.
МЕТОДИКА
Объектом исследования служили инбредная линия 3629 подсолнечника, а также внеядерные пестролистные формы, полученные на ее основе.
Растения выращивали в полевых и лабораторных условиях. В последнем случае проростки выращивали в темноте (этиолированные) или в режиме 14-часового дня (освещенность 0.04 или 11 Вт/м2) и 10-часовой ночи до 38-дневного возраста при 20-22°С (в особых случаях при 28-30°С). Зеленение этиолированных проростков проводили на свету в режиме, используемом для выращивания растений. Для анализа пигментов в полевых условиях брали высечки из зеленых и му-тантных участков листьев в фазу бутонизации растений. В лабораторных опытах использовали фенотипически полностью белые листья мутанта var10, контролем служили зеленые листья ин-бредной линии 3629.
Для накопления 5-аминолевулиновой кислоты (АЛК) срезанные листья инкубировали 3 ч на свету либо в темноте на 0.05 М растворе левулино-вой кислоты в 0.1 М Трис-НС1-буфере, рН 7.5. Определение АЛК проводили согласно [11], используя молярный коэффициент экстинкции для АЛК равный 6.8 х 104 М-1 см-1 [12].
Для изучения ресинтеза протохлорофиллида (Пд) растения затемняли на 17 ч. Для накопления предшественников Хл из экзогенной АЛК листья срезали и помещали на 17 ч в темноту на раствор 5 мМ АЛК, рН 6.5.
Скорректированные спектры флуоресценции листьев регистрировали in vivo при -196°С при спектральной ширине щели возбуждающего
и регистрирующего монохроматоров - 2 нм, со светофильтром ОС-13 перед регистрирующим монохроматором [13]. Спектры поглощения листьев регистрировали при -196°С на спектрофотометре UVIKON 931 ("Kontron Instruments", Германия).
Содержание Хл a, b и каротиноидов оценивали по спектрам поглощения 85%-ных ацетоновых экстрактов листьев [14], в листьях с низким содержанием Хл - по спектрам флуоресценции. Содержание Пд оценивали по спектрам флуоресценции отмытых гексаном водно-ацетоновых (ацетон + 0.1 N NH4OH, 9 : 1, по объему) экстрактов растений, как описано в [15].
Препараты для электронной микроскопии готовили по стандартной методике [16] из мутант-ных и зеленых участков первой пары настоящих листьев пестролистных растений, выращенных в полевых условиях. Срезы получали на ультрамикротоме ЬКБ-Ш-4801 A ("LKB", Щвеция) и исследовали на электронном микроскопе JEM-100B ("Jeol", Япония).
Для определения относительного содержания 70S и 80S рибосом листья гомогенизировали в 0.01 М фосфатном буфере рН 7.5 (1 : 0.5; вес : объем). Гомогенат подвергали аналитическому ультрацентрифугированию при 42 тыс. об/мин и 20°С (ультрацентрифуга Spinko E, ротор AnD, "Beck-man", США).
Активность РБФК определяли радиометрически при 30°С во фракции растворимых белков по Романовой с сотр. [17]. Для экстракции растворимых белков листья гомогенизировали в 2-кратном объеме 0.1 М Трис-НС1-буфера, рН 8.0, содержащем 0.2 М NaCl, 0.5 М ЭДТА, 0.01 М MgCl2 и 0.06 М Р-меркаптоэтанол. Гомогенат центрифугировали при 20000 g в течение 30 мин при 4°С. Супернатант использовали в качестве препарата РБФК. Содержание белка определяли по методу Lowry c соавт. [18]. Удельную активность выражали в мкмоль/(мг белка мин).
Использовали препараты фирмы "Sigma" (США): АЛК, левулиновую кислоту, Р-меркаптоэтанол, Трис-HCl.
В таблицах приведены средние арифметические значения величин из 3-10 независимых опытов, выполненных в 3-кратной повторности, и их стандартные ошибки.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Пестролистные растения изучаемых линий при самоопылении расщепляются в потомстве на 3 типа проростков: с зелеными, пестрыми, а также полностью белыми или желтыми листьями (летальные). Граница между нормальной зеленой и мутантной тканями пестролистных растений всегда выражена четко. При ее электронно-мик-
Рис. 1. Ультраструктура гетеропластидной клетки пестролистного мутанта подсолнечника (уаг10). НП - нормальная пластида, МП - мутантная пластида, ТС - тилакоидные мембраны стромы, ТГ - тилакоидные мембраны гран, Р - рибосомы.
роскопическом исследовании наряду с клетками, содержащими только нормальные или мутант-ные пластиды, были отмечены гетеропластид-ные клетки (рис. 1). На снимке хорошо видно наличие в одной клетке (линии уаг10) пластид двух типов. Ультраструктура мутантной пластиды (слева) типична для пластид белой мутантной ткани: наряду с наличием рибосом пластид внутренние мембранные структуры практически полностью отсутствуют (рис. 2). В них часто наблюдаются ос-миофильные глобулы, представляющие собой неструктурированные агрегаты белково-липид-ных компонентов внутренних мембран. Внутренняя структура нормальной пластиды сходна с ультраструктурой пластид исходной зеленой линии 3629, имеющей хорошо развитую мембранную си-
стему, состоящую из тилакоидов стромы и тилако-идов гран (рис. 3).
В литературе описан ряд внеядерных хлоро-фильных мутантов высших растений и водорослей, характеризующихся пониженным содержанием или отсутствием 70Б рибосом [2]. Определение относительного количества 70Б рибосом в зеленых (линия 3629), белых (уаг9,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.