НЕЙРОХИМИЯ, 2012, том 29, № 1, с. 11-18
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 612:822.3
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ПРЕСИНАПТИЧЕСКИХ АФФЕРЕНТОВ И ИХ ЗАВИСИМОСТЬ ОТ АКТИВНОСТИ КАСПАЗЫ-3 В ПЕРЕЖИВАЮЩИХ СРЕЗАХ
ГИППОКАМПА КРЫС © 2012 г. И. В. Кудряшова*, М. В. Онуфриев, Н. В. Гуляева
Учреждение Российской академии наук Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва
В поле СА1 переживающих срезов гиппокампа крыс регистрировали фокальные ответы при разной интенсивности тестирующего раздражения коллатералей Шаффера, затем определяли активность каспазы-3 и калпаина в каждом отдельном срезе. Сравнение ответов при одной и той же интенсивности тестирующего раздражения показало, что снижение амплитуды пресинаптического компонента и амплитуды популяционного спайка сопровождалось достоверным увеличением активности каспазы-3. Влияния калпаина при той же интенсивности выявить не удалось. Изменение амплитуды пресинап-тического компонента при увеличении интенсивности тестирующего раздражения соответствовало логистическому закону. Судя по изменениям соотношения коэффициентов аппроксимирующих функций, увеличение активности каспазы-3 сопровождается снижением плотности афферентации СА1 и возбудимости пресинаптических афферентов, что подтверждается результатами корреляционного анализа и математического моделирования. Несмотря на то что амплитуда популяционного спайка при одной и той же интенсивности тестирующего раздражения достоверно коррелировала с активностью каспазы-3, вряд ли этот фермент участвует в регуляции взаимодействия ВПСП—спайк, поскольку никаких существенных различий в свойствах аппроксимирующих функций не обнаружено. Ни одна из протеаз не оказывала влияния на величину параметров, зависящих от числа доступных для активации нейронов; следовательно, мало вероятно, что активация каспазы-3 в срезах гиппокампа сопровождается гибелью нейронов. Показано, что, линейная функция аппроксимации наиболее соответствует зависимости амплитуды популяционного ВПСП от величины пресинаптического компонента ответа. При этом наклон линии регрессии не зависит от активности каспазы-3 или калпаина. По-видимому, при обычных условиях тестирования исследуемые протеолитические ферменты в переживающих срезах гиппокампа не влияют на свойства синапсов.
Ключевые слова: переживающие срезы гиппокампа, пресинаптический залп, фокальный ВПСП, популя-ционный спайк, метод аппроксимирующих функций, каспаза-3, калпаин.
В регуляции межклеточных взаимодействий и структурной реорганизации синапсов важная роль принадлежит различным ферментным системам. В частности, протеолитические ферменты выполняют множество функций на самых разных субклеточных уровнях [1, 2]. Одним из самых распространенных методов определения физиологических функций ферментов в условиях полной (in vivo) или частичной (переживающие срезы) сохранности исследуемого участка нервной ткани является использование ингибиторов, реже — препаратов, усиливающих активность фермента.
Ранее нами было обнаружено, что ингибиторы каспазы-3 влияют на свойства СА3—СА1 синапти-ческой передачи [3—5]. Очевидно, что регулятор-ные изменения активности ферментов происходят в отдельных компартментах, тогда как действие
* Адресат для корреспонденции, 117485, Москва, ул. Бутлерова 5а, e-mail: iv_kudryashova@mail.ru.
препаратов, активирующих или ингибирующих исследуемый фермент, не только не ограничивается отдельным компартментом, но и захватывает целые популяции клеток, оказывающихся в зоне подведения. Вследствие этого вряд ли можно быть окончательно уверенным в прямом действии препаратов на исследуемый процесс и исключить вероятность опосредованного действия, связанного с изменениями активности в соседних компарт-ментах или клетках. Оценка того, как происходящие естественным образом изменения активности ферментов влияют на реорганизацию функциональных свойств нейронных ансамблей, могла бы существенно повлиять на дальнейшее развитие наших представлений о молекулярных механизмах центральных функций.
К сожалению, используемые в настоящее время методы не позволяют количественно оценить распределение активности ферментов в отдельных нейронах переживающих срезов гиппокам-
па, и тем более в клеточных компартментах. В связи с этим активность фермента, определяемую в целом срезе, можно сопоставить лишь с общими для популяции нейронов показателями, и соответственно экстраклеточная регистрация в этих условиях является предпочтительной. К тому же, достаточную репрезентативность выборки трудно обеспечить при внутриклеточной регистрации, учитывая тот факт, что размер выборки в одном срезе ограничен, как правило, несколькими нейронами, имеющими самые устойчивые характеристики.
Множественность субстратов протеолитиче-ских ферментов, влияющих на трансдукцию сигнала на разных субклеточных уровнях, а также существенная нелинейность статистических взаимодействий затрудняет непосредственное выявление их участия при прямом измерении отдельных показателей нейронных реакций и, тем более, количественную оценку такого участия. К тому же одна и та же величина ответа может поддерживаться разными механизмами. Слоистая структура и достаточно хорошо изученная структурно-функциональная организация [6—8] дают возможность регистрировать моносинаптические реакции в переживающие срезах гиппокампа и интерпретировать отдельные составляющие экстраклеточных фокальных потенциалов. В частности, достаточно хорошо изучены механизмы генерации отдельных компонентов фокального потенциала, регистрируемого в поле СА1 в ответ на стимуляцию колла-тералей Шаффера [9, 10].
Ранее был разработан метод аппроксимирующих функций, позволяющий в условиях регистрации фокальных потенциалов исследовать характеристики афферентного притока в их совокупности [5]. В данной работе мы использовали этот метод для того, чтобы определить, какие модификации передачи САЗ—СА1 соответствуют естественной вариабельности активности каспа-зы-3. Предполагалось также сопоставить эффекты спонтанной активации каспазы-3 и калпаина на электрофизиологические показатели.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Электрофизиологические эксперименты проводили на переживающих срезах гиппокампа крыс Вистар массой 90-180 г. Состав перфузионной среды (мМ): NaCl 124; KCl 5; MgSO4 • 7H2O 1.3; CaCl2 2.5; NaH2PO4 1; NaHCO3 26; D-глюкоза - 10; кар-боген — 95% O2 и 5% CO2; pH 7.3-7.4, температура 34.3°С. Регистрацию суммарной электрической активности из пирамидного слоя проводили в поле СА1 стеклянным микроэлектродом, заполненным 0.33 M раствором хлористого натрия. Раздражающие биполярные электроды устанавливали в радиальном слое на коллатерали Шаффера. Помимо амплитуды популяционного спайка из-
меряли наклон fEPSP и амплитуду пресинаптиче-ского компонента при разной интенсивности тестирующего раздражения.
Сразу после тестирования срезы замораживали при температуре —70°С. Активность протеоли-тических ферментов определяли в каждом отдельном срезе флуориметрическим методом. Для определения активности каспазы-3 пробы инкубировали в течение 60 мин при 37°С в реакционном буфере, содержащем 150 мМ HEPES, pH 7.4, 15% сахарозу, 15 мМ дитиотрейтол, 0.15% CHAPS (все — Sigma, США), 1 мМ ЭДТА, в двух параллельных образцах, один из которых содержал 50 мкМ ^ацетил-Асп-Глу-Вал-Асп-7-амино-4-трифтор-метилкумарин (Ac-DEVD-AMC, флуорогенный субстрат каспазы-3, Biomol, США), а другой 50 мкМ М-ацетил-Асп-Глу-Вал-Асп-7-амино-4-метилкумарин и 5 мкМ N-ацетил-Асп-Глу-Вал-Асп-CHO (Ac-DEVD-CHO, конкурентный ингибитор каспазы-3, Biomol, США), конечная концентрация белка составляла 0.5 мг/мл. Флуоресценцию регистрировали при длинах волн возбуждения и эмиссии 400 нм и 490 нм соответственно на спектрофлюориметре Hitachi F-3000, оборудованном микрокюветой. Активность кас-пазы-3 рассчитывали по разности скоростей накопления свободного 7-амино-4-метилкумарина в пробах, содержащих и не содержащих специфический ингибитор каспазы-3, и выражали в пмоль/мин/мг белка. В качестве флуоресцентного стандарта использовали 7-амино-4-метилку-марин (Sigma, США). Определение активности калпаина проводили флюориметрическим методом с использованием синтетического субстрата suc-LLVY-AMC (N-сукцинил-Лей- Лей-Вал-Тир-7-амино-4-метилкумарин). Для определения активности калпаина пробы инкубировали 60 мин при 37°С в реакционном буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl, рН 7.4, 5 мМ CaCl2, 1 мМ ДТТ, 50 мкМ suc-LLVY-AMC, конечная концентрация белка составляла 0.5 мг/мл. Для определения специфичности расщепления субстрата Сa2+-зави-симым калпаином в параллельный образец вносили все компоненты, кроме 5 мМ CaCl2, и по 10 мМ ЭДТА и ЭГТА. Флуоресценцию образовавшегося АМС регистрировали, как описано выше. Активность калпаина рассчитывали по разнице скоростей расщепления suc-LLVY-AMC в образцах в присутствии Сa2+ или хелаторов Сa2+.
Для того чтобы определить степень участия протеолитических ферментов в регуляции специфических механизмов, определяющих сетевые свойства нейронов гиппокампа, экспериментальные данные о соотношении амплитуд пресинап-тического компонента, популяционного спайка и крутизны нарастания ВПСП при разной интенсивности тестирующего раздражения были проанализированы с помощью математической модели, описывающей соответствующие зависимо-
Лре = Атах/(1 + еа - Ъх О)
Апс = Атах/(1 + еа - Ъх (0)
ШПСП = а + Ъх(1)
г = 0.25; р = 0.06
Рис. 1. Связь между активностью каспазы-3 и свойствами пресинаптических афферентов является основным фактором, определяющим остальные взаимодействия.
Представлены схематическое изображение и блок-схема СА3—СА1синаптических взаимодействий. Над линией, соединяющей отдельные блоки, показан уровень значимости корреляционного взаимодействия соответствующих признаков. Для аппроксимации зависимости амплитуды пресинаптического компонента от интенсивности тестирующего раздражения и взаимодействия ¡ВПСП-спайк использованы логистические функции. Пресинаптический компонент и ¡ВПСП связаны между собой линейно. Обоснование и физиологический смысл коэффициентов аппроксимации изложены в тексте статьи.
сти с использованием наиболее правдо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.