КРИСТАЛЛОГРАФИЯ, 2014, том 59, № 4, с. 594-599
СТРУКТУРА МАКРОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
УДК 577.23
СТРУКТУРНЫЕ И ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ДИНАМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ РЕАКЦИОННОГО ЦЕНТРА Rhodobacter sphaeroides И ЕГО МУТАНТНОЙ
ФОРМЫ L(M196)H + H(M202)L
© 2014 г. В. Г. Кляшторный, Т. Ю. Фуфина*, Л. Г. Васильева*, В. А. Шувалов*,
А. Г. Габдулхаков
Институт белка РАН, Пущино E-mail: azat@vega.protres.ru *Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино Поступила в редакцию 12.08.2013 г.
Пигмент-белковые взаимодействия обеспечивают высокую эффективность переноса и преобразования световой энергии при фотосинтезе. Наиболее удобным объектом для изучения механизмов первичных процессов фотосинтеза является реакционный центр (РЦ) пурпурной бактерии Rhodobacter sphaeroides. С помощью направленного мутагенеза можно исследовать влияние белкового окружения кофакторов переноса электрона на оптические свойства, стабильность, пигментный состав и функциональную активность РЦ. Предварительный анализ РЦ проводился с помощью компьютерного моделирования аминокислотных замещений L(M196)H + H(M202)L в пигмент-белковом интерфейсе и определения стабильности пространственной структуры полученного мутантно-го РЦ методом молекулярной динамики. Затем РЦ с указанной двойной мутацией был получен, очищен и закристаллизован, его пространственную структуру определили методом рентгенострук-турного анализа и сравнили с молекулярно-динамической моделью.
DOI: 10.7868/S0023476114040092
ВВЕДЕНИЕ
Фотосинтез — один из фундаментальных процессов, происходящих в биосфере Земли. В результате протекающей при фотосинтезе серии последовательных реакций переноса электрона и протона световая энергия превращается в энергию химических связей в органических соединениях. Одной из главных особенностей работы фотосинтетического аппарата является высокая эффективность преобразования энергии солнечного света, составляющая почти 100% на начальных этапах фотосинтеза. Выяснение принципов и механизмов преобразования и запасания энергии света при фотосинтезе — одна из основных задач современной биологии. К настоящему времени пространственные структуры бактериальных реакционных центров (РЦ) определены с высоким разрешением. Это позволяет исследовать механизмы первичных реакций фотосинтеза, изменяя параметры фотопереноса электрона за счет варьирования состава и свойств молекул кофакторов, участвующих в нем, с помощью модификации их белкового окружения.
Реакционный центр пурпурной бактерии Кко^Ьас1ег sphaeroides (КЬа. ърНае^йеъ) представляет собой трансмембранный пигмент-белковый комплекс, состоящий из трех полипепти-
дов Ь, М, Н и десяти кофакторов: димера бакте-риохлорофиллов (БХл) специальной пары РА и РВ, которая является первичным донором электрона, двух молекул мономерного БХл (ВА и ВВ), двух молекул бактериофеофитина (БФео) (НА и НВ), двух молекул убихинона (РА и рВ), иона не-гемового железа Бе2+ и молекулы каротиноида. Ьи М белковые субъединицы РЦ содержат по пять трансмембранных а-спиралей, расположенных псевдосимметрично [1].
Замена в субъединице Ь гистидина 173 на лейцин Н(Ь173)Ь приводит к утрате атома магния в молекуле БХл РА [2] и превращению в БФео. В [3] показано, что в РЦ двойного мутанта 1(Ь177)Н + + Н(Ь173)Ь в отсутствие нативного лиганда, гистидина Ь173, координирование атома магния БХл РА сохраняется. Было высказано предположение, что в качестве лиганда может выступать аминокислотный остаток гистидина, расположенный в позиции Ь177, или молекула воды [3]. Для исследования возможности образования координационной связи между атомом магния молекулы БХл РВ и искусственно введенным гисти-диновым лигандом с другой стороны специальной пары нами получены РЦ с двойной заменой гистидина М202 в субъединице М на лейцин и лейцина М196 на гистидин (Ь(М196)Н + Н(М202)Ь). В на-
у,град у,град
Рис. 1. Карта Рамачандрана для белковых компонентов РЦ дикого типа: стартовая кристаллическая структура (а) и структура после 50 нс молекулярной динамики (б). Для каждой структуры приведен процент аминокислотных остатков, находящихся в наиболее предпочтительных областях карты Рамачандрана.
стоящей работе описаны молекулярно-динамические исследования РЦ Rba. sphaeroides и его му-тантной формы L(M196)H + H(M202)L. Созданы и протестированы библиотеки с параметрами ограничений и констант для многочисленных кофакторов, входящих в состав РЦ. Получена и закристаллизована мутантная форма РЦ L(M196)H + + H(M202)L, определена ее кристаллическая структура. Проведен сравнительный анализ мо-лекулярно-динамически рассчитанной модели РЦ c кристаллической структурой полученного генетически модифицированного РЦ.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Молекулярно-динамическое моделирование РЦ выполнено в программе Gromacs 4.5 [4] с использованием полноатомных силовых полей Charmm27 [5, 6]. Длины ковалентных связей с участием атомов водорода были ограничены с помощью алгоритма LINCS [7], что позволило использовать шаг интегрирования 2 фс. Электростатические взаимодействия оценивались с помощью метода Эвальда (PME, Particle Mesh Ewald) [8, 9]. Для описания ван-дер-ваальсовых взаимодействий использовались функции сглаживания "switch" в интервале от 10 до 12 Â. Температура поддерживалась постоянной (300 K) с помощью алгоритма шкалирования атомных скоростей (v-rescale) [4]. Давление контролировалось с помощью баростата Берендсена [10] на уровне 1 атм.
В качестве стартовых моделей молекулярной динамики использовались две пространственные структуры РЦ. Одна из них — кристаллическая структура РЦ Rba. sphaeroides дикого типа (PDB
код 3V3Y) [3], другая — это та же структура с заменами гистидина М202 на лейцин и лейцина М196 на гистидин, проведенными в программе Coot [11]. Система была сольватирована молекулами воды [12] добавлением слоя в 12 Â вокруг белка по всем трем направлениям (общее число молекул воды для каждой из задач составило около 40000). Для всех систем использовались периодические граничные условия и ортогональный водный бокс. Кислые и основные аминокислотные остатки рассматривались заряженными: Glu и Asp несли СОО—-группу, тогда как Arg и Lys были полностью протонированы и несли заряд +1. Общий заряд системы нейтрализовался добавлением шести моновалентных противоионов Na+. Сольватиро-ванные системы подвергались процедурам минимизации энергии и уравновешивания водного бокса в течение 50 пс с фиксированным положением белковой системы и кофакторов. Цель данной процедуры — поиск наиболее благоприятных контактов, образуемых молекулами воды с поверхностью растворенной системы. После этого были рассчитаны 50 нс молекулярно-динамиче-ские траектории при температуре 300 К. Все траектории рассчитывались с использованием ресурсов Московского межведомственного суперкомпьютерного центра (МСЦ РАН, www.jssc.ru). Координаты системы сохранялись и анализировались каждую 1 пс. Качество структуры и ее сте-реохимические параметры контролировались на различных стадиях траектории с помощью программы Procheck (рис. 1) [13].
Мутагенез, выделение, очистка и кристаллизация РЦ Rba. sphaeroides. Мутагенез РЦ пурпурной бактерии Rba. sphaeroides проводили, как описано
596
КЛЯШТОРНЫИ и др.
ранее [14]. Клетки рекомбинантного штамма ЯЬа. sphaeroides выращивали в полуаэробных условиях в темноте при 34° С на среде Хатнера в присутствии тетрациклина (1 мкг/мл), канами-цина (5 мкг/мл) и стрептомицина (5 мкг/мл).
Выделение РЦ проводили, как описано в [15], но с некоторыми модификациями. Хроматофоры растворяли в 20 мМ Трис-НС1 буфере рН 8.0, содержащем 120 мМ №С1 и 0.3% лаурилдиметил-амин оксида (ЛДАО), и инкубировали 20 мин с последующим повышением концентрации ЛДАО сначала до 0.5% (20 мин), а затем до 0.7% (20 мин). После инкубации обработанные хроматофоры центрифугировали при 45 000 об/мин 60 мин. На-досадочную жидкость, содержащую РЦ, наносили последовательно на колонки с диэтиламино-этил и диэтиламиноэтил целлюлозой. Промывку колонок проводили 20 мМ Трис-НС1 буфером рН 8.0, 0.1% ЛДАО с постепенным повышением концентрации №С1 до 135 мМ. Затем РЦ элюирова-ли 200 мМ ШС1 в 20 мМ Трис-НС1 буфере рН 8.0 с 0.1% ЛДАО.
Кристаллизацию генетически модифицированного РЦ ЦМ196)Н + Н(М202)Ь проводили при 289 К методом диффузии летучих паров, как описано в [16].
Таблица 1. Кристаллографические данные и параметры съемки кристаллов мутантной формы РЦ ЦМ196)Н + Н(М202)Ь
Пространственная группа Р3121 (№ 152)
а, Ь, с, А 140.04, 140.04, 184.62
а, в, у, град 90.0, 90.0, 120.0
И, кДа 105
Число мономеров в незави- 1
симой части
Длина волны, А 0.91841
Разрешение, А 50.0-2.9 (3.0-2.9)*
Число измеренных рефлексов 283135 (20990)
Расстояние кристалл-детек- 352.15
тор, мм
Область качания, град 0.5
Область вращения, град 100.0
Число независимых рефлексов 46696 (4240)*
Повторяемость 6.03 (4.95)*
Полнота набора, % 99.5 (95.4)*
Мозаичность, град 0.212
Среднее значение //ст(Т) 10.17 (1.74)*
Кте^е, % 18.6 (89.5)*
Коэффициент Мэтьюза (Ут), 5.02
Да/А3
Содержание растворителя, % 75.31
Сбор дифракционных данных с кристаллов РЦ. Дифракционные данные кристаллов мутантной формы РЦ собраны с разрешением 2.9 А с одного кристалла на линии ВЫ4-1, Берлин, Германия. Набор данных получен при длине волны 0.91841 А и температуре 100 К. Технические параметры эксперимента по сбору дифрагированного кристаллами РЦ набора интенсивностей и значения статистических параметров фурье-спектров даны в табл. 1. Первичная обработка экспериментального набора интенсивностей и выбор стратегий обработки проведены в программе 1Мо8Яш [17]. Получение результирующих наборов интенсивно-стей осуществлено в комплексе программ XDS [18].
Таблица 2. Статистические характеристики уточнения структуры мутантной формы РЦ ЦМ196)Н + Н(М202)Ь
Параметры Величина
Область разрешения, А 43.2-2.9 (2.96-2.9)*
Число рефлексов в рабочем наборе 46694 (2512)*
Число рефлексов в тестовом наборе 2335 (132)*
Срезка набора, \Г | > 2.03 ст
Число неводородных атомов 7434
в мономере
Число белковых субъединиц 3
в мономере
Количество молекул кофак-
торов в мономере:
бактериохлоро
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.