КРИСТАЛЛОГРАФИЯ, 2010, том 55, № 3, с. 503-509
ЖИДКИЕ КРИСТАЛЛЫ
УДК 577.352.2+538.9
СТРУКТУРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЛИПИДНЫХ МЕМБРАН НА СИНХРОТРОННОМ ИСТОЧНИКЕ СИБИРЬ-2
© 2010 г. М. А. Киселев1, Е. В. Ермакова1, Н. Ю. Рябова12, О. В. Найда3, А. В. Забелин3, Д. К. Погорелый3, В. Н. Корнеев4, А. М. Балагуров1
1 Объединенный институт ядерных исследований, Дубна
E-mail: kiselev@nf.jinr.ru 2Научно-исследовательский институт ядерной физики Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова 3 Курчатовский центр синхротронного излучения и нанотехнологий, Российский научный центр "Курчатовский институт", Москва 4 Институт биофизики клетки РАН, Пущино Поступила в редакцию 16.07.2009 г.
Липидные мембраны являются объектом современных междисциплинарных исследований на стыке биологии, биофизики, фармакологии, бионанотехнологии. В работе представлены результаты структурных исследований нескольких различных типов липидных мембран с помощью ламелляр-ной и латеральной дифракции синхротронного излучения в рентгеновском диапазоне. Эксперименты проведены на станциях Дикси и Медиана синхротронного источника Сибирь-2 РНЦ КИ. Полученные результаты сравниваются с результатами измерений липидных мембран, выполненных на установках малоуглового рассеяния D22, D24 в LURE (Франция) и A2 в DESY (Германия). Показано, что параметры установки Дикси удовлетворяют основным требованиям для исследований структурной организации липидных систем, представляющих интерес как с фундаментальной, так и с прикладной точек зрения.
ВВЕДЕНИЕ
Биологические и модельные структуры на основе липидных мембран уже давно и успешно изучаются методами рассеяния нейтронов и рентгеновского излучения [1]. С помощью дифракции и малоуглового рассеяния рентгеновских лучей или тепловых нейтронов удается определить основные геометрические параметры мембран, их зависимость от внешних условий и от присутствия каких-либо встроенных или присоединенных молекул. В благоприятных случаях возможен анализ внутренней структуры мембраны с разрешением на уровне отдельных молекул. Такого рода исследования, помимо чисто научного интереса, имеют и большое практическое значение. Достаточно упомянуть усиленно развивающиеся в последние годы технологии изготовления на основе липосом новых переносчиков лекарств.
Основной тенденцией последних лет является все более широкое использование для изучения надатомной структуры мембран современных установок коллективного пользования — источников синхротронного излучения и нейтронных источников. Сравнительно недавно в России в РНЦ "Курчатовский институт" был введен в строй специализированный синхротрон Сибирь-2 (http://www.kcsr.kiae.ru/), на станциях которого
возможно проведение структурных исследований биологических объектов с помощью коротковолнового излучения [2]. Были выполнены эксперименты на станциях Дикси и Медиана, основная цель которых состояла в выяснении возможностей этих станций для изучения структуры мембран различного типа и, прежде всего, липидных мембран в избытке воды. Для экспериментов использовалась дифракция (упругое рассеяние) излучения с длиной волны около 1.5 А в области малых (до ~5°) и средних (до ~15°) углов. В настоящей работе представлены результаты экспериментов и проведено сравнение станций Дикси (http://www.kcsr.kiae.ru/stations/kl.3a.php) [3] и Медиана (http://www.kcsr.rU/stations/k4.3.php) с возможностями установок аналогичного типа на западноевропейских синхротронных источниках.
СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЛИПИДНЫХ МЕМБРАН
Биологические мембраны играют ключевую роль в формировании и функционировании клеток. В большинстве случаев их структуру можно представить как липидный бислой со встроенными в него белковыми молекулами. С точки зрения кристаллографии биологические мембраны являются жидким кристаллом. Однако их многообразие, сложность и многокомпонентность сильно
Рис. 1. Два различных фазовых состояния липидного бислоя. Слева схематично изображена Хр'-фаза, а справа — Рп'-фаза; dm — толщина липидного бислоя (мембраны), du — длина ондуляции.
затрудняет изучение их наноструктуры методами дифракции. Это является причиной того, что в основном структурные исследования ведутся на модельных мембранах, приготовленных из искусственных или выделенных из клеток липидов. Особенно широко изучаются мембраны, приготовленные из фосфолипидов, например, из фос-фатидилхолинов, которые являются основной компонентой мембран животных клеток, или це-рамидов, которые являются главной компонентой липидной матрицы верхнего слоя кожи млекопитающих stratum corneum (SC).
Степень разрешимости задачи изучения структуры мембраны зависит от степени ее упорядоченности. От многослойных ориентированных мембран на подложках и многослойных везикул (МСВ) — липосом удается наблюдать несколько порядков отражения излучения от периодической ламеллярной структуры. Их анализ позволяет получить информацию об основных параметрах мембраны — периоде повторяемости многослойной структуры, толщине липидного бислоя, распределении воды между бислоями, размерах гидрофильной и гидрофобной областей. При типичном периоде липидной мембраны 60 А и измерении нескольких (иногда до 10) порядков отражения рентгеновских лучей или нейтронов разрешение в реальном пространстве может составлять ~4 А. Этого зачастую достаточно для выводов о структуре бислоя и определения позиций встроенных в него молекул. Латеральная дифракция (с направлением переданного импульса параллельно поверхности мембраны) позволяет получать информацию об упаковке липидных молекул в плоскости бислоя [1]. Для определения геометрических характеристик однослойных ли-пидных везикул в большом избытке воды (прототипов переносчиков лекарств) используются методы малоуглового рассеяния рентгеновских лучей и нейтронов. Такие эксперименты позволяют определять форму и размер везикулы, степень полидисперсности везикулярной системы, толщину липидного бислоя, толщину гидрофобной части бислоя [4].
Липидный бислой димиристоилфосфатидил-холина (ДМФХ) и дипальмитоилфосфатидилхо-
лина (ДПФХ) существует в различных фазовых состояниях. Переход из одного фазового состояния в другое сопровождается изменением структуры мембраны как в ламеллярном (перпендикулярном поверхности мембраны), так и в латеральном (параллельном поверхности мембраны) направлениях. На рис. 1 представлены два фазовых состояния мембран из ДМФХ и ДПФХ: гель фаза (Zp) и волнистая (ripple) фаза (Рр). Lp-фаза характеризуется упорядоченной конформацией углеводородных цепей. При этом цепи наклонены по отношению к нормали бислоя, а упаковка углеводородных хвостов соответствует двумерной деформированной гексагональной решетке. В Рр-фазе возникают флуктуации поверхности мембраны, наклон цепей, в основном, сохраняется, но упаковка цепей становится более симметричной. Структура мультислойной мембраны в Рр-фазе характеризуется двумерной косоугольной решеткой. Физические причины возникновения флуктуаций мембранной поверхности являются объектом современных исследований. Методом рентгеновской дифракции в реальном времени установлено, что Рр-фаза является суперпозицией двух фазовых состояний: Lp - и La-фазы [5]. При комнатной температуре (около 18°С) липидный бислой ДМФХ находится в Рр-фазе, а бислой ДПФХ в Lp-фазе [7, 6].
В настоящей работе представлены результаты ламеллярной и латеральной дифракции синхро-тронного излучения на липидных мембранах, приготовленных из ДПФХ, ДМФХ и церамидов, составляющих липидную матрицу верхнего слоя кожи млекопитающих. Мембраны фосфолипи-дов подробно изучались ранее одним из соавторов этой статьи [7—11] на синхротронных источниках, что открыло возможность детального сравнения результатов, получаемых на станциях источника Сибирь-2 и на некоторых западноевропейских источниках, ориентированных на исследования липидных систем.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ОБРАЗЦОВ
ДМФХ, ДПФХ и модельная мембрана липидной матрицы SC были выбраны для измерений, так как при комнатной температуре они находятся в различных фазовых состояниях. Образцы готовились в виде МСВ (липосом) в избытке воды и помещались в кварцевые капилляры диаметром 1.5 мм и толщиной стенки 0.01 мм производства фирмы GLAS, Германия. Концентрация ДМФХ в воде составляла 20 мас. %. Образцы из ДПФХ были притоговлены при концентрации липида в воде 20 и 1 мас. %. Образец с 1% содержанием ДПФХ был приготовлен в тяжелой воде для последующих измерений методом рассеяния нейтронов.
20% ДПФХ
102г
0 0.1 0.2 0.3 0.4
9, А-1
Рис. 2. Спектры ламеллярной дифракции от многослойных везикул ДПФХ, измеренные при концентрации ДПФХ в воде 20 и 1 мас. % на спектрометре Дикси при температуре 18°С. Концентрация ДПФХ в воде указана на рисунке.
I, отн. ед. 1250
1000
750
500
250
0
UJ
0.05 0.10 0.15 0.20 0.25
q
0.30
. Ä-1
Рис. 3. Дифракционный спектр от 1% раствора ДМФХ в воде при температуре 20°С (Pß-фаза). Спектрометр D22, LURE. Первый и второй порядок отражения соответствуют периоду повторяемости мембраны 65.1 ± 0.6 Ä.
Необходимое количество сухого порошка ли-пида растворялось в воде. МСВ самоорганизовываются при нагревании раствора выше температуры главного фазового перехода (41°С для ДПФХ, 23° С для ДМФХ). Затем раствор выдерживался при этой температуре в течение 20 мин и охлаждался до -5°С. Цикл "нагрев-охлаждение" повторялся три раза. Последней операцией перед измерением был нагрев образца. Однослойные липидные везикулы (ОСВ) приготавливались из МСВ экструзией через поры диаметром 500 А.
Концентрация липидов модельной мембраны 8С составляла 2 мас. % в тяжелой воде. Липидный состав образца модельной мембраны 8С представляет собой сложную многокомпонентную систему с весовым содержанием главных компонент: церамид 6-55%; смесь жирных кислот — 15%, холестерин — 25%, сульфат холестерина — 5%. Смесь жирных кислот представляет собой главные жирные кислоты липидной матрицы 8С млекопитающих и содержит пальмитиновую (С16:0), стеариновую (С18:0), арахиновую (С20:0), бегеновую (С22:0), лигноцериновую (С24:0) и це-ротиновую кислоты (С26:0) в мольном соотношении: С16:0/С18:0/С20:0/С22:0/С24:0/С26:0= 1.3/3.3/6.7/41
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.