БИОЛОГИЯ МОРЯ, 2007, том 33, № 3, с. 217-222
УДК 591.3 БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ
СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ В БЕСПОЛОМ РАЗМНОЖЕНИИ КОЛОНИАЛЬНОЙ АСЦИДИИ BOTRYLLUS TUBERATUS (TUNICATA: ASCIDIACEA)1
© 2007 г. А. В. Ахмадиева, А. И. Шукалюк, Я. Н. Александрова, В. В. Исаева
Институт биологии моря ДВО РАН, Владивосток 690041 e-mail: inmarbio@mail.primorye.ru
Статья принята к печати 23.11.2006 г.
Проведено гистологическое, цитохимическое и ультраструктурное исследование почкования колониальной асцидии Botryllus tuberatus с целью поиска стволовых клеток. В ранних почках B. tuberatus впервые обнаружены плотная масса недифференцированных клеток, а также локальная связь наружного эпидермального и внутреннего атриального эпителиев. Недифференцированные клетки, найденные в ранних почках и сосудистой системе колонии, обладают морфологическими признаками стволовых и первичных половых клеток многоклеточных животных. В развивающихся почках и некоторых клетках популяции гемоцитов выявлена интенсивная экспрессия активности щелочной фосфатазы, цитохимического маркера эмбриональных стволовых и первичных половых клеток позвоночных животных. На основании литературных и собственных данных предполагается, что самообновляющийся резерв стволовых клеток колониальной асцидии B. tuberatus - клеточная основа репродуктивной стратегии, включающей половое и бесполое размножение.
Ключевые слова: колониальные асцидии, Botryllus, репродуктивная стратегия, бесполое размножение, стволовые клетки.
Stem cells in asexual reproduction of the colonial ascidian Botryllus tuberatus (Tunicata: Ascidiacea).
A. V. Akhmadieva, A. I. Shukalyuk, Ya. N. Aleksandrova, V. V. Isaeva (Institute of Marine Biology, Far East Branch, Russian Academy of Sciences, Vladivostok 690041)
A histological, cytochemical and ultrastructural study of budding in the colonial ascidian Botryllus tuberatus was performed to search stem cells. A dense mass of undifferentiated cells, as well as local connection of outer epidermal and inner atrial epithelia were observed in early buds of B. tuberatus. The undifferentiated cells in the early buds and in the vascular system of the colonial ascidian had morphological features typical of metazoan stem and primary germ cells. Developing buds and some cells of the hemocyte population showed an intensive expression of alkaline phosphatase activity known as a cytochemical marker of vertebrate embryonic stem and primary germ cells. We suggest that the self-renewing pool of stem cells in B. tuberatus provides the cellular basis for realization of the reproductive strategy including both asexual and sexual reproduction. (Biologiya Morya, Vladivostok, 2007, vol. 33, no. 3, pp. 217-222).
Key words: colonial ascidians, Botryllus, reproductive strategy, asexual reproduction, stem cells.
Асцидии (Tunicata, или ишЛоМай), как известно, принадлежат к типу хордовых вместе с ланцетником и позвоночными. Недавно появились свидетельства большей степени филогенетического родства позвоночных именно с представителями Титса!а, а не с ланцетником (Cephalochordata), вопреки общепринятой точке зрения (Рекис et а1., 2006). Колониальным асци-диям рода Во^Пш свойственно паллеальное (атриаль-ное, или перибранхиальное) почкование с образованием нового бластозооида на боковой стенке бластозоои-да предыдущего бесполого поколения. С одной стороны, классические данные исследований почкования колониальных асцидий рода Во1гу11ш описывают формирование почки наружным эпидермисом материнского зооида и внутренним утолщенным диском его атриаль-ного (перибранхиального) эпителия, который затем образует все органы развивающегося бластозооида (Вет11, 1961; Иванова-Казас, 1978). С другой стороны, на колониальной асцидии Во1гу11ш schlosseri показано, что сосудистая система колонии содержит и переносит
стволовые клетки, дающие начало половой и соматическим линиям клеток (Pancer et al., 1995; Stoner, Weissman, 1996; Stoner et al., 1999; Weissman, 2000; Rinkevich, 2002; Laird, De Tomaso, 2004/2005; Laird et al., 2005). У Botryllus primigenus найдено также сосудистое почкование - образование почек сосудистой системы из эндотелия и агрегатов клеток крови; подобный тип бесполого размножения наблюдали в экспериментальных условиях после удаления всех зооидов колонии Botrylloides violaceum (см.: Berrill, 1961).
Стволовые клетки колониальных асцидий, в том числе и модельного объекта многих исследований -B. schlosseri, до сих пор морфологически не идентифицированы и остаются загадочными. Выделены и изучены клетки крови колониальной асцидии Botrylloides leachi и других представителей асцидий; среди гемоцитов найдены "стволовые" клетки, гемобласты (Burighel, Cloney, 1997; Cima et al., 2001; Sunanaga et al., 2006) -возможные кандидаты на роль предполагаемых тотипо-тентных или мультипотентных стволовых клеток, спо-
1Работа поддержана грантами РФФИ (№ 06-04-48744, 06-04-63092 и 06-04-96039) и грантом ДВО РАН (№ 06-III-A-06-162).
собные дифференцироваться в половые клетки (Sunana-ga et al., 2006).
В рамках проводимых нами исследований структурной и функциональной организации стволовых клеток многоклеточных животных и в связи с противоречивостью литературных данных о клеточных источниках бесполого размножения асцидий рода Botryllys целью нашей работы было морфологическое и цитохимическое исследование почкования колониальной асцидии Botryllys tuberatus с поиском стволовых клеток. В качестве цитохимического маркера тотипотентных клеток беспозвоночных была применена реакция выявления активности щелочной фосфатазы (Исаева и др., 2003; Shukalyuk et al., 2005), используемая для идентификации эмбриональных стволовых и первичных половых клеток позвоночных, прежде всего млекопитающих.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Колонии Botryllus tuberatus Ritter et Forsyth, 1917 были собраны в сентябре 2005 г. в зал. Восток (зал. Петра Великого Японского моря). Для гистологического исследования участки колоний фиксировали жидкостью Буэна, обезвоживали в спиртах, заливали в парафин; срезы толщиной около 5 мкм окрашивали гематоксилином. Для электронно-микроскопического анализа участки колонии фиксировали 2.5% раствором глютаральдегида в какодилатном буфере (pH 7.4), дофикси-ровали в 2% четырехокиси осмия (OsO4), дегидратировали этанолом и ацетоном и заключали в эпон-аралдит. Тонкие срезы, полученные с помощью ультратома Ultracut-E (Reichert), контрастировали 2% раствором уранилацетата и цитра-
та свинца и изучали с помощью трансмиссионного электронного микроскопа JEM 100B. Для выявления активности щелочной фосфатазы применяли протокол, принятый для эмбриональных стволовых клеток млекопитающих, в модификации для тотальных препаратов колониальных беспозвоночных животных (Исаева и др., 2003; Shukalyuk et al., 2005).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Морфология бластозооидов Botryllus tuberatus типична описанной ранее у представителей рода Botryllus. Почка, развивающаяся при паллеальном почковании на латеральной стороне материнского бластозооида, снаружи покрыта эпидермисом, локально связанным с внутренним атриальным (перибранхиальным) эпителием (рис. 1а). Внутренний клеточный слой неоднороден и помимо эпителиальных клеток включает плотную клеточную массу с морфологическими признаками недифференцированных эмбриональных стволовых клеток (рис. 1б). Такие клетки содержат крупное ядро с диффузным хроматином и большим плотным ядрышком; объем цитоплазмы относительно размера ядра невелик (рис. 1б, в).
Цитоплазма стволовых клеток содержит митохондрии, многочисленные рибосомы; явные морфологические признаки цитодифференциации отсутствуют. На срезах таких клеток встречаются центриоли (рис. 2а, б) и мелкие перинуклеарные тельца, сходные с герми-нальными. Изолированные клетки подобной морфологии найдены внутри кровеносных сосудов колонии B. tuberatus (рис. 2б).
Рис. 1. Строение ранней почки Во^уйт ыЬега^. а - связь эпидермального и атриального эпителиев (гистологический препарат, окраска гематоксилином); б, в - ультраструктура стволовых клеток вблизи зоны контакта наружного и внутреннего эпителиев. Обозначения: а - атриальный эпителий, э - эпидермальный эпителий, я - ядро, як - ядрышко.
Рис. 2. Ультраструктура недифференцированных стволовых клеток Во^Нш tuberatus. а - клетка ранней почки; б - гемобласт, стволовая клетка крови. Обозначения: м - митохондрия, ц - центриоль, я - ядро, як - ядрышко.
Цитохимическая реакция выявления активности щелочной фосфатазы вызывала интенсивное окрашивание зооидов, развивающихся почек и части клеточной популяции гемоцитов в сосудах и сосудистых ампулах (рис. 3а, б), причем специфическая кирпично-красная окраска таких клеток по цвету и интенсивности подобна окраске культивируемых эмбриональных стволовых клеток мыши, использованных ранее в качестве контроля. Положительную цитохимическую реакцию проявляли также некоторые клетки туники вне сосудов кровеносной системы. По крайней мере, часть окрашенных клеток популяции гемоцитов и туники - клетки с крупным ядром и ядрышком и узким ободком интенсивно окрашенной цитоплазмы, хотя идентифицировать при этом тип клетки трудно, а в интенсивно окрашиваемых почках - практически невозможно.
ОБСУЖДЕНИЕ
У беспозвоночных животных с бесполым размножением (соматическим эмбриогенезом и клональной
репродукцией) не происходит раннего выделения линии половых клеток и ее явного обособления от линии соматических стволовых клеток до развития гонад (Buss, 1999; Blackstone, Jasker, 2003). В то же время линия тотипотентных (по крайней мере, мультипотент-ных) стволовых клеток, способных к дифференциации во все типы (или широкий спектр) клеток организма, включая клетки половой линии, поддерживается в течение жизни индивида или колонии, что наиболее убедительно продемонстрировано на планариях (Shibata et al., 1999; Isaeva et al., 2005). Примерами таких стволовых клеток, помимо классических необластов турбел-лярий, больших интерстициальных клеток книдарий, а также стволовых клеток колониальных корнеголовых ракообразных, впервые обнаруженных и исследованных нами (Isaeva et al., 2001, 2004; Shukalyuk et al., 2005, 2006),
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.