БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 3, с. 428-436
МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА =
УДК 573.3
СУПЕР ПАРАМАГНИТНЫЕ НАНОЧАСТИЦЫ ФЕРРИТА КОБАЛЬТА «ВЗР ЫВАЮТ» УПОРЯДОЧЕННУЮ П Р ОСТР АН СТВЕННУЮ УПАКОВКУ ДВУХЦЕПОЧЕЧНЫХ МОЛЕКУЛ ДНК
© 2015 г. Ю.М. Евдокимов, А.Г. Першина*, В.И. Салянов, А.А. Магаева**, В.И. Попенко, Э.В. Штыкова***, Л.А. Дадинова***, С.Г. Скуридин
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 119991, Москва, ул. Вавилова, 32;
E-mail: yevdokim @eimb. ru *Сибирский государственный медицинский университет, 634050, Томск, Московский тракт, 2;
E-mail: allysyz@mail.ru
**Томский научный Центр Сибирского отделения РАН, 634021б Томск, А кадемический просп. 10/3;
***Институт кристаллографии им. А .В. Шубникова РАН, 119333, Москва, Ленинский просп., 59;
E-mail: viwopisx@yachoo.ru Поступила в p едакцию 11.02.15 г.
Рассмотрено формирование холестерических жидкокристаллических дисперсий из двухцепо-чечных молекул ДНК, обработанных положительно заряженными суперпарамагнитыми нано-частицами феррита кобальта, а также действие этих наночастиц на жидкокристаллические дисперсии ДНК. Связывание магнитных наночастиц с линейными двухцепочечными молекулами ДНК в растворе высокой ионной силы (0,3 М NaCl) и последующее фазовое исключение таких комплексов из полиэтиленгликольсодержащего раствора приводит к тому, что формирование дисперсии, для частиц которой характерно пространственное спиральное расположение соседних двухцепочечных молекул ДНК, становится невозможным. При действии магнитных наночастиц на холестерическую жидкокристаллическую дисперсию ДНК (1 магнитная нано-частица на 1 молекулу ДНК) происходит такое «возмущение» структуры молекул ДНК в местах связывания магнитных наночастиц, при котором упорядоченная пространственная структура частиц дисперсии ДНК «взрывается»; этот процесс сопровождается исчезновением как аномальной оптической активности, так и брэгговского пика на кривой малоуглового рассеяния. С учетом того, что физико-химические свойства частиц жидкокристаллических дисперсий двухцепочечной ДНК отражают особенности пространственной организации этих молекул в составе хромосом простейших, не исключено, что обнаруженный эффект может иметь важные биологические последствия.
Ключевые слова: жидкокристаллические дисперсии ДНК, суперпарамагнитные наночастицы феррита кобальта, круговой дихроизм, малоугловое рентгеновское рассеяние.
Ряд недавно опубликованных обзорных р а -бот [1-7] посвящен анализу свойств гибр идных материалов, образованных в результате диспергирования наночастиц в жидкокр исталлических фазах низкомолекулярных соединений. Изучение таких материалов находится в фокусе интенсивных исследований в разных лабораториях; они обусловлены возможностями практического применения этих материалов (создание экранов для компьютер ов, устр ойств для хра-
Сокращения: ЖКД ДНК - жидкокристаллическая дисперсия ДНК, ПЭГ - полиэтиленгликоль, КД - круговой дихроизм, МНЧ - магнитные наночастицы, УЗ - ультразвук, ХЖКД ДНК - холестерическая жидкокристаллическая дисперсия ДНК, МУР - малоугловое рентгеновское рассеяние.
нения информации и т.д., и даже доставка лекарственных препар атов).
Нужно отметить, что хотя многие из этих работ посвящены анализу свойств жидких кристаллов низкомолекулярных соединений, обработанных наночастицами серебра или золота [8,9], начаты работы по действию таких нано-частиц на жидкие кристаллы, образованные высокомолекулярными ДНК [10,11]. Результаты этих р абот вызывают большой интер ес с р азных точек зрения. Этот интерес основан, прежде всего, на том, что в настоящее время установлены многие параметры, характеризующие физико-химические свойства и структуру частиц дисперсий ДНК [12]. В частности, показано, что частицы жидкокристаллических дисперсий
(ЖКД) двухцепочечной ДНК (молекулярная масса ~ (0,6-0,8)-106 Да), образующиеся при фазовом исключении этих молекул из водно-по-лимер ных р астворов (в частности, раствора по-лиэтиленгликоля (ПЭГ)) имеют размер около 500 нм, в со став каждой частицы входят ~104 молекул ДНК. Частицы дисперсии ДНК существуют в растворах ПЭГ, имеющих определенное осмотическое давление. Частицы характеризуются периодической структурой, расстояние между слоями которой может меняться в пределах от 2,9 до 5,0 нм в зависимости от осмотического давления раствора. Анизотропия молекул двухцепочечной ДНК приводит к тому, что каждый следующий слой из молекул ДНК в частице дисперсии повернут на определенный (~ 0,5°) угол по отношению к предыдущему. Такая закрутка приводит к формированию про -странственно закрученной (холестерической) структуры частицы дисперсии ДНК, характерной особенностью которой является появление очень интенсивной (аномальной) полосы в спектре кругового дихроизма (КД) в области поглощения азотистых оснований ДНК [13]. С биологической точки зрения интерес к этим частицам обусловлен тем, что физико-химические свойства частиц ЖКД двухцепочечной ДНК отражают некоторые особенности про -странственной организации этих макромолекул в составе хромосом Protozoa (например, хро-мосом Dinoflagellate), ДНК-содержащих бактериофагов [14] и головок спермиев.
В результате пр оведенных исследований было показано, что наночастицы золота при низкой концентрации не только «запрещают» упо -рядоченную упаковку молекул двухцепочечной ДНК, но и нарушают спиральную структуру частиц ЖКД ДНК [15,16]. Этот эффект может быть одной из причин генотоксического действия этих наночастиц [17].
Цель настоящей р аботы - опр еделение эффектов, которые могут быть вызваны действием другого типа наночастиц, а именно суперпара-магнитных наночастиц (МНЧ) феррита кобальта, на формирование и свойства ЖКД ДНК. С ледует отметить, что, несмотр я на целый ряд обзоров и обзорных статей [18-22], в которых анализируются свойства МНЧ, механизмы их взаимодействия с молекулами ДНК остаются малоизученными, а вопрос о возможности потенциального токсического (генотоксического) действия этих наночастиц остается практически без ответа.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
МНЧ получали методом механохимическо-го синтеза с использованием кристаллогидратов солей. Детали метода подробно описаны в ра -боте [23].
Оценка показывает, что в 1 мг порошка МНЧ содержится 1,32-1015 наночастиц. Перед использованием исходную суспензию МНЧ разбавляли 0,3 М КаС1 до концентрации 1,5 мг/мл (1,98-1015 МНЧ/мл) и готовили серию ра створов с разным содержанием МНЧ (суспензии А). Поскольку МНЧ обладают склонностью к агрегации [19,21], агрегаты в суспензиях А разрушали с помощью ультразвукового (УЗ) дис-пергатора «УЗДН -2Т» (Россия; частота 22 кГц, температур а ~ 0оС, вр емя УЗ-обработки 5 мин). Известная степень разбавления серии суспензий А и измерение их поглощения при 400 нм использовано для построения зависимости оптической плотности суспензий от концентрации МНЧ. Сохранение прямолинейной зависимости свидетельствует о том, что при разбавлении суспензий в них меняется лишь концентрация МНЧ (без существенного изменения размера или фор мы самих наночастиц). После низкоскоро стного центрифугирования серии растворов А (центрифуга МР,^251 (Польша); 6000 об/мин, температура 22°С, 4 мин) отбирали супернатанты (суспензии Б) и регистрировали оптическую плотность этих суспензий. Для суспензий серии Б также наблюдается прямолинейная зависимость оптической плотности от разбавления, что подтверждает постоянство размер а и фор мы МНЧ в суспензиях сер ии Б. Поэтому данные, полученные для суспензий серии А, можно использовать для определения концентрации МНЧ в суспензиях серии Б. В результате описанной процедуры приготовления в полученных супернатантах (серия Б) о с-тается 5% исходного (серия А) количества МНЧ.
П ри помощи электр онного микро скопа 1еш-100СХ (1ео1, Япония) оценивали средний размер МНЧ в суспензиях серии А и Б. На рис. 1а,б, в качестве примера, показан вид МНЧ, а на рис. 1в - гистограмма размеров МНЧ, приготовленных в р азных условиях. Согласно оценкам, в суспензиях А и Б диаметр сферических МНЧ лежит в пределах от 4 до 6,5 нм, что вполне соответствует результатам, полученным ранее [20]. На пленке-подложке, используемой для электронной микроскопии, эти наночасти-цы образуют агрегаты, которые (при использованной процедуре приготовления) состоят из разного числа МНЧ (в зависимости от их концентрации).
Рис. 1. Электронные микрофотографии магнитных наночастиц (а, б), использованных в работе, и распределение МНЧ по размеру (в). (а) - Концентрация МНЧ 1,32-1015 частиц/мл (1 мг/мл). Раствор А после приготовления подвергали УЗ-обработке, но не центрифугировали. (б) - Концентрация МНЧ 0,462-1014 частиц/мл (0,035 мг/мл). Супернатант получен после центрифугирования раствора А. (в) - Разные столбики соответствуют разным сериям определения размера МНЧ. Отметка на рисунке соответствует 100 нм.
МНЧ имели положительный заряд; их Ъ-потенциал при нейтральных значениях pH со -ставлял около 15 мВ.
Суспензии серии Б использовали для приготовления комплексов с двухцепочечной ДНК, смешивая фиксированные объемы суспензии Б с определенным объемом водно-солевого раствора ПЭГ, содер жащего холестер ическую жидкокристаллическую дисперсию ДНК (ХЖКД ДНК).
Использовали дополнительно очищенный от примесей и деполимеризованный препарат ДНК из тимуса кр упного рогатого скота (Sigma, США) с молекулярной массой (0,6-0,8) -106 Да. Концентрацию ДНК в водно-солевых растворах определяли спектрофотометрически, пользуясь известным значением молярного коэффициента поглощения (к = 258.4 нм, етах = 6600 М-1см-1).
П репар ат ПЭГ (Serva, Гер мания; молекулярная масса 4000 Да) использовали без дополнительной очистки.
ХЖКД ДНК в ПЭГ-содержащих водно-со -левых растворах формировали в соответствии с методикой, описанной ранее [12].
Магнитными наночастицами (суспензии серии Б), полученными описанным выше спосо -бом, обрабатывали как исходные линейные молекулы двухцепочечной ДНК, так и ХЖКД ДНК.
Спектры поглощения исследуемых растворов регистрировали при помощи спектр офото-метра Сагу 100 Бсап (Уапап, США), а спектры кругового дихроизма - при помощи портативного дихрометра СКД-2 (разра
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.