РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2013, том 53, № 1, с. 71-75
= НЕИОНИЗИРУЮЩИЕ ИЗЛУЧЕНИЯ =
УДК 579.842.1:577.344.2:577.354.2
СВЕТОЧУВСТВИТЕЛЬНАЯ МЕТАБОЛИЧЕСКАЯ СЕТЬ В КЛЕТКАХ Escherichia coli: СПЕКТРАЛЬНАЯ СЕЛЕКТИВНОСТЬ И РЕПАРАТИВНЫЕ ФУНКЦИИ ГЛОБИНОВЫХ ФОТОРЕЦЕПТОРОВ © 2013 г. О. А. Тифлова*
Институт проблем лазерных и информационных технологий РАН, Троицк
Исследовано влияние излучения He-Ne лазера (632.8 нм), некогерентного монохроматического красного света в диапазоне 601—685 нм, а также импульсного излучения полупроводникового лазера (660 нм) на рост культуры клеток E. coli дикого типа или uvrA штамма WP2 и трансформацию ДНК плазмиды pDick (Amp, Km) у E. coli NM522. После светового воздействия фотоприрост числа клеток в культуре сохраняется в течение нескольких генераций, а повышение эффективности плаз-мидной трансформации наблюдается только по маркеру устойчивости к канамицину, что позволяет предположить, что рецептором красного света является метаболическая сигнальная сеть. Обнаруженная нами спектральная селективность указывает на существование ассоциированной с мембраной флавогемоглобиновой пероксидазы жирных кислот как на фоточувствительный компонент репаративной сети. Предполагается, что повышенная эффективность воздействия света в отношении uvrA штамма обусловлена фотоактивацией глобиновой EcDOS фосфодиэстеразы в качестве О2-провайдера для AlkB деметилазы.
Фоточувствительная репаративная сеть, флавогемоглобиновая пероксидаза жирных кислот, глобино-вый О2-провайдер для AlkB деметилазы.
DOI: 10.7868/S0869803112060148
Способность лазерного излучения красной и ближней инфракрасной областей спектра проникать на значительную глубину в водные среды, окружающие клетки и ткани, может служить основой для разработки методов дистанционного воздействия на клеточные фоторецепторы. Ранее нами было показано, что одним из рецепторов излучения He-Ne лазера в клетках бактерий E. coli является сопряженный с глобином сенсор О2 — EcDOS фосфодиэстераза цАМФ, включенный в светочувствительную сигнальную сеть [1]. Сигнальные сети — информационные структуры, сопрягающие цепи передачи сигнала, поступающего от различных рецепторов, контролируют инициацию процесса обработки информации, причем особую роль в процессе преобразования сигнала в макроскопическое поведение клеток отводится биофизическим свойствам мембран, позволяющим свести воедино различные уровни регуляции сети и определяющим динамику процесса [2]. В клетках бактерий E. coli содержится глобиновый рецептор лазерного излучения — флавогемоглобин, способный менять свои спектральные характеристики при ассоциации с мембраной [3], а также участвовать в восстановлении биофизических свойств мембран в качестве пе-
* Адресат для корреспонденции: 142190 Троицк, Московская обл., ул. Пионерская, 2, ОПЛТ ИПЛИТ РАН: тел.: (495) 334-03-43; факс: (495) 334-02-01; e-mail: vtiflov@inr.ru.
роксидазы жирных кислот [4]. Цель настоящей работы — определение спектральных и временных параметров светового излучения, при которых светочувствительная сигнальная сеть осуществляет репаративные функции за счет включения в свой состав ассоциированного с мембраной флавогемоглобина.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Исследовали влияние на рост культуры бактерий Escherichia coli WP2 штамма uvrA или дикого типа излучений He-Ne лазера (632.8 нм), а также полупроводникового лазера (660 нм, 26, 700 или 1000 Гц) или лампы накаливания с монохромато-рами (611 ± 10 нм, 619 ± 10, 630 ± 7, 640 ± 7, 650 ± 18 или 670 ± 15 нм). В облучаемых или контрольных (не облучаемых) образцах культур концентрация клеток составляла 5—8 х 108 клеток в 1 мл буфера. Культура в начале пострадиационной инкубации содержала 7—8 х 107 клеток в 1 мл богатой питательной среды. Культивирование бактерий в богатой питательной среде, облучение и подсчет жизнеспособных клеток проводили, как описано ранее [1].
В экспериментах по фотоиндуцированной трансформации в облучаемой суспензии концентрация клеток бактерий E. coli NM522 составляла 5—7 х 108 кл/мл, концентрация ДНК плазмиды
72
ТИФЛОВА
6 г
0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 Время пострадиационной инкубации
Рис. 1. Зависимость фото прироста числа клеток в культуре E. coli WP2 дикого типа облученной светом He-Ne лазера (60 с, 4.8 кДж/м2) от времени пострадиационной инкубации.
pDick [5], несущей гены устойчивости к ампициллину и канамицину, — 2—5мкг/мл. При проведении трансформации по стандартной методике с использованием теплового шока количество трансформантов в необлученных образцах, высеянных без подращивания в жидкой среде на плотную агаризованную среду LB, содержащую ампициллин (50мг/мл) или канамицин (50мкг/мл), составляло 4—6 х 103 устойчивых к канамицину и 2—4 х 104 устойчивых к ампициллину клонов на 1 мкг плазмидной ДНК.
Эксперименты проводили при слабом естественном освещении. Каждая точка на рисунке представляет среднее из 3—5 независимых экспериментов по три повторности в каждом.
РЕЗУЛЬТАТЫ
На рис. 1 представлены результаты экспериментов по изучению отдаленных эффектов облучения клеток бактерий дикого типа E. coli WP2 светом He-Ne лазера. Исследование кривых роста контрольной (необлученной) и облученной в течение 60 с культур показало, что фотоприрост числа клеток в облученной культуре достигает максимума к 1.5 ч пострадиационной инкубации и остается на постоянном уровне, по крайней мере, до 2.5 ч, что в наших условиях соответствует прохождению культурой четвертого—пятого деления клеток.
Облучение светом He-Ne лазера приводит также к повышению компетентности клеток бактерий. Эффект светового излучения проявляется и в случае, когда смесь бактерий и плазмид высевается на твердую питательную среду немедленно после облучения. При облучении смеси бактерий E. coli NM522 с плазмидной ДНК в течение 60— 180 с эффективность трансформации возрастает
<ч
1.8 -
0.2-1-1-1-^-1-1-1
0 50 100 150 200 250 300 350
Время облучения, с
Рис. 2. Зависимость эффективности трансформации бактерий E. coli NM522 ДНК плазмиды pDick по маркерам устойчивости к канамицину (1) или ампициллину (2) от времени облучения смеси бактерий и плазмид светом He-Ne лазера.
на 40—70% в случае высева на твердую среду с добавлением канамицина, антибиотика, ингибиру-ющего синтез белка (рис. 2, кривая 1). В случае ампициллина, убивающего клетки, приступившие к делению, облучение смеси бактерий и плазмидной ДНК приводит к снижению количества устойчивых клонов до 40% от контрольного уровня (рис. 2, кривая 2).
Исследование влияния излучения He-Ne лазера на рост культуры радиочувствительного штамма uvrA показало, что зависимость эффекта излучения от дозы света имеет колоколообразную форму (рис. 3). Оптимальное время облучения — около 60 с, и доза излучения — около 4 кДж/м2 соответствуют характерным для дикого типа WP2 параметрам. Однако уровень стимуляции штамма uvrA (рис. 3, кривая 2) значительно превышает уровень 150—170%, наблюдаемый в случае дикого типа (рис 3, кривая 1). Отношение числа клеток в облученной светом He-Ne лазера и контрольной (необлученной) культурах штамма uvrA после полуторачасовой инкубации в питательной среде превышает 300%.
В дальнейших экспериментах мы сравнивали влияние на рост культуры дикого типа E. coli WP2 излучения He-Ne лазера и других источников монохроматического излучения в красной области спектра. Время облучения составляло 60—180 с, доза излучения 4.0—4.8 кДж/м2, время пострадиационной инкубации 1.5 ч. Некогерентное излучение, выделенное из света лампы накаливания с помощью монохроматора с длиной волны 630 ± 7 нм, и свет He-Ne лазера — 632.8 нм, обес-
печивают одинаковый уровень стимуляции культуры дикого типа ЖР2, составляющий 158 и 162% соответственно (таблица). Близкие уровни стимуляции наблюдаются при облучении микробных клеток светом с длиной волны 611 ± 10 нм — 180% и 614 ± 10 нм — 164%. Непрерывное световое излучение с длиной волны 640 ± 7, 650 ± 18 или 670 ± 15 нм не влияло в наших условиях на рост культуры. В отличие от непрерывного света, импульсное излучение полупроводникового лазера с частотой повторения импульсов 26, 700 или 1000 Гц при длине волны 660 нм обеспечивает стимуляцию роста культуры на уровне до 200% при облучении культуры в течение 60 с. Результаты экспериментов, представленных в таблице, показывают, что эффект стимуляции слабо зависит от когерентности и степени монохроматичности излучения и определяется в основном спектральными характеристиками света. Исследование зависимости эффекта от времени облучения показало, что в случае воздействия излучения полупроводникового лазера с частотой повторения импульсов 1000 Гц кривая имеет колоколообраз-ную форму, соответствующую кривой для непрерывного света (рис. 3, кривая 1; и рис. 4, кривая 1). В случае частот повторения импульсов 26 и 700 Гц (рис. 4, кривые 2и 3) уровень стимуляции достигает 180—200% и в интервале 60—600 с не зависит от времени облучения.
3.0 г
00 о
а 2.5 -
£
л
w 2.0 -
ч
Ч
0.5
10 100 1000 Время, с
Рис. 3. Влияние излучения He-Ne лазера (80 Вт/м2) на рост культур дикого типа (1) и штамма uvrA (2) E. coli WP2. Культуры в начале пострадиационной инкубации содержали 7—8 х 107 клеток в 1 мл богатой питательной среды
ОБСУЖДЕНИЕ
Одним из формальных признаков вовлечения в регуляцию клеточных процессов сигнальной сети является продолжительность клеточного ответа после короткого сигнала. В наших экспериментах мы наблюдали устойчивый фотоприрост числа клеток в культуре в течение нескольких ге-
2
Влияние красного света на рост культуры дикого типа E. coli WP2
Длина волны, нм Источник излучения Характер воздействия, (нерпрерыв-ное или импульсное облучение), Гц Средняя мощность излучения, Вт/м2 Время облучения, с Доза излучения, кДж/м2 Отношение числа клеток в облученной и необлученной культурах
611± 10 Лампа накаливания с монохроматором Непрерывное 22.5 180 4.0 1.80 ± 0.21
619 ±10 » » 25.0 160 4.0 1.64 ± 0.17
630 ± 7 » » 22.5 180 4.0 1.60 ± 0.18
632.8 He-Ne лазер » 80.0 60 4.8 1.62 ± 0.15
640 ± 7 Лампа накаливания с монохроматором » 22.2 180 4.0 1.01 ± 0.09
650 ± 18 » » 22.2 180 4.0 0.97 ± 0.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.