ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 3, с. 409-415
УДК 581.1
СВЕТОВАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В ЛИСТЬЯХ Arabidopsis МаНапа
© 2007 г. В. Н. Попов, Д. Н. Федорин, А. Т. Епринцев
Воронежский государственный университет, Воронеж Поступила в редакцию 30.07.2006 г.
Рассматривается один из возможных механизмов световой регуляции активности сукцинатдегидро-геназы (СДГ) в листьях Arabidopsis ЛаНапа. Методами дот-гибридизации и полимеразной цепной реакции в реальном времени установлено, что в растениях А. thaliana дикого типа количество мРНК исследуемого фермента менялось в зависимости от условий освещения. В темноте число копий мРНК СДГ было значительно выше, чем на свету. Анализ мутантных растений А. thaliana по генам фитохрома А и В показал, что в регуляции активности фермента принимал участие фитохром А. Активная форма фитохрома А снижала уровень экспрессии гена SDH1-2, что обуславливало уменьшение ферментативной активности исследуемого фермента.
Arabidopsis ЛаНапа - сукцинатдегидрогеназа - ферментативная активность - экспрессия гена -фитохромная система
ВВЕДЕНИЕ
Фермент сукцинат:убихиноноксидоредуктаза (сукцинатдегидрогеназа, СДГ, КФ 1.3.5.1) входит в состав комплекса II электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) митохондрий и осуществляет процесс окисления сукцината в фумарат и превращение убихинона в убихинол. СДГ функционирует в двух процессах клетки: ЦТК и электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) митохондрий. В эукариоти-ческих организмах СДГ комплекс представлен четырьмя полипептидами. Полипептид СДГ1 имеет в своем составе ковалентно связанный ФАД, в составе СДГ2 присутствует 3 железо-серных ^е-Б) кластера. Комплекс СДГ1-СДГ2 обращен в матрикс и при помощи цитохром Ь-обога-щенной фракции СДГ3 и СДГ4 закрепляется в мембране [1, 2]. Мембраносвязанный комплекс обладает способностью восстанавливать убихи-нон, однако димер СДГ1-СДГ2 может осуществлять только окисление сукцината [2], но природный акцептор для димера не установлен.
Сокращения: КС - красный свет; ДКС - дальний красный свет; ПЦР - полимеразная цепная реакция; ПЦР-РВ - ПЦР в реальном времени; ЭТЦ - электрон-транспортная цепь; СДГ - сукцинатдегидрогеназа; ДХФИФ - дихлорфенолин-дофенол; ФМС - феназинметасульфат; ББС-буфер - 75 мМ цитрат N и 750 мМ №С1, рН 7.0.
Адрес для корреспонденции: Попов Василий Николаевич. 394006 Воронеж, Университетская пл., 1. Воронежский государственный университет, кафедра физиологии и биохимии растений. Факс: 007 (4732) 20-87-55; электронная почта: pvn@bio.vsu.ru
Комплекс II митохондрий Arabidopsis thaliana кодируется ядерным геномом. Так, СДГ1 кодируется двумя генами: SDH1-1 и SDH1-2; СДГ2 кодируется тремя генами: SDH2-1, SDH2-2 и SDH2-3; СДГ3 кодируется двумя генами: SDH3-1 и SDH3-2, а СДГ4 одним геном.
Кодирование СДГ большим количеством генов может свидетельствовать о важной роли данного фермента в регуляции метаболизма растений. Очень важным представляется изучение уровня экспрессии каждого гена в определенных условиях.
Много работ посвящено изучению изменения уровня экспрессии генов, кодирующих СДГ2, содержащую железо-серные кластеры. В частности, Alvaro с соавт. [3] установили, что при прорастании арабидопсиса происходило изменение экспрессии генов, кодирующих субъединицу СДГ2. Так, в покоящихся семенах экспрессиро-вался только ген SDH2-1, но уже на 15-й час прорастания происходили перестройки в функционировании генома, и экспрессия этого гена прекращалась. В то же время, уровень экспрессии генов SDH2-2 и SDH2-3 значительно возрастал. В другой работе [4] было показано, что при цветении арабидопсиса также происходили изменения в уровне экспрессии генов СДГ2 в разных частях цветка.
Однако известно очень мало работ, посвященных изучению регуляции флавин-содержащей субъединицы СДГ, в частности изменению экспрессии генов SDH1-1 и SDH1-2 под действием различных факторов среды.
КС дкс
4 Темнота \ Темнота
- л
Темнота Темнота
л
и -
& ^ „ га 2 Темнота
-
1 Темнота Свет Темнота Свет
Отбор проб
_I_I_I_I_I_I_I_I_I_♦_I_
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Время, ч
Рис. 1. Схема проведения опытов по влиянию условий освещения на экспрессию гена и активность СДГ в зеленых листьях А. ЛаНана.
1 - растения, освещенные белым светом; 2 - растения, выдержанные в темноте; 3 - растения, освещенные КС в течение 15 мин в середине темнового периода; 4 - растения, последовательно освещенные КС и ДКС в течение 15 мин в середине темнового периода.
Актуальным представляется изучение взаимосвязи между такими важными процессами в растительной клетке как фотосинтез, фотодыхание и дыхание. Один из механизмов, с помощью которого может осуществляться регуляция этих процессов, включает функционирование фитохром-ной системы [5]. Ранее было установлено, что фи-тохромная система участвует в регуляции активности ключевого фермента дыхания растений - СДГ [6]: на свету происходило значительное угнетение работы фермента, что, вероятно, было связано с действием активной формы фитохрома.
Известно, что фитохром участвует в регуляции активности многих ферментов. Показано, что под действием фитохрома изменялся уровень экспрессии гена нитратредуктазы, что было опосредовано G-белками и приводило к изменению количества белка этого фермента [7]. Также установлено, что фитохром А служил посредником в регуляции светом синтеза фермента биосинтеза хлорофилла НАДФ • Н-протохлорофил-лидоксидоредуктазы [8]. В растениях А. ЛаНана, мутантных по генам фитохромов А и В, установлено, что фитохромная система регулирует НАД • Н-дегидрогеназу митохондрий; при этом красный свет вызывал увеличение количества транскрипта гена NDA1 [9].
Ранее было показано, что свет не оказывал прямого действия на активность электрофорети-чески гомогенной СДГ [10]. В связи с этим целью нашей работы было изучение изменения в экспрессии генов, кодирующих белок СДГ1 в зеленых листьях арабидопсиса, в зависимости от усло-
вий светового режима и выяснение механизма регуляции этого процесса.
МЕТОДИКА
В работе использовали 24-дневные проростки Arabidopsis thaliana L., выращенные в почве по стандартной методике [11] при 12-часовом световом дне с интенсивностью света 25 Вт/м2. В работе использовали семена трех линий растений A. thaliana: растения дикого типа (Col-0), мутанты по гену фитохрома A (phya-201) и мутанты по гену фитохрома В (phyb-1), полученные из Института Макса Планка (Гольм, Германия).
Источником белого света служили лампы дневного света в установке "Флора-1". Красный свет (KC) и дальний красный свет (ДКС) получали с помощью светодиодов с областью испускания 640-680 нм (КИПД40М40-К-П6, Россия) и 710-750 нм (3Л127А-5, Россия). Интенсивность света составляла 0.044 Вт/м2. Величина данной интенсивности света достаточна для индукции сигнальных реакций, связанных с участием фито-хромной системы, но не вызывает интенсификации протекания фотосинтеза [12].
Опыты проводили по следующей схеме. Часть растений выдерживали в течение 48 ч при стандартных условиях выращивания растений (12-часовой фотопериод). Этот вариант обозначен на рисунках как "белый свет". Растения второй группы инкубировали 48 ч в темноте. Третью группу растений после 24-часовой инкубации в темноте освещали КС с длиной волны 660 нм в течение 15 мин и затем инкубировали 24 ч в темноте. И, наконец, четвертую группу растений после 24-часовой инкубации в темноте освещали КС с длиной волны 660 нм в течение 15 мин, затем ДКС с длиной волны 730 нм в течение 15 мин, после чего инкубировали 24 ч в темноте (рис. 1).
Суммарную РНК выделяли из 0.2 г зеленых листьев арабидопсиса с помощью гуанидин-тио-цианат-фенол-хлороформного метода [13] с использованием хлорида лития в качестве осаждающего агента. Качество выделенной РНК определяли электрофоретически в 1%-ном агарозном геле [14]. Концентрацию измеряли на спектрофотометре СФ-46 ("ЛОМО", Россия). Обратную транскрипцию проводили с помощью обратной транскриптазы M-MuLV ("Fermentas", Литва) с использованием олиго-dT праймера. Для синтеза кДНК использовали 3 мкг суммарной РНК. Полученную кДНК растворяли в 10 мМ Трис-НС1-бу-фере, рН 8.0, содержавшем 0.1 мМ ЭДТА, и использовали для анализа методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени (ПЦР-РВ).
Очистку ампликона осуществляли методом электрофореза в 1%-ном агарозном геле. По-
лосу, соответствующую ПЦР-продукту, вырезали из геля, ДНК элюировали с помощью набора QIAEX® II Gel Extraction Kit (150), согласно рекомендациям производителя. Очищенный ам-пликон секвенировали в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (Пущино) и сравнивали с нуклеотидной последовательностью SDH1-2 A. thaliana. Сравнение показало, что эти нуклеотидные последовательности были идентичны.
Праймеры для ПЦР анализа были специфическими для SDH1-2: прямой - 5'-GAGTTTGT-TCAGTTTCATCC-3'; обратный - 5'-GTGCAT-TATAATATGGGTGG-3'. Подбор праймеров осуществляли на основе сравнения аминокислотных последовательностей субъединицы А СДГ (СДГ1) из разных организмов. Для этого использовали базу данных NCBI. Выравнивание последовательностей проводили с помощью программы AliBee - Multiple alignment Release 2.0. ПЦР-РВ проводили на приборе ДТ-322 ("ДНК-Технология", Россия), используя в качестве красителя SYBR Green. Параметры амплификации: предварительная денатурация при 95° в течение 5 мин, затем 35 циклов: 95° - 20 с, 57° - 20 с, 72° - 15 с, 72° - 15 с (детекция) и, наконец, 72° - 4 мин. Количество матрицы контролировали с помощью параллельной амплификации 18S рРНК с ген-специфичными праймерами. При проведении 35 циклов амплификации с суммарной РНК, не прошедшей этапа обратной транскрипции, мы не наблюдали накопления ПЦр-продукта.
Дот-блот-анализ осуществляли с РНК растений, инкубированных при разных условиях освещения. На нейлоновую мембрану Hybond N ("Amer-sham", Англия) наносили 4 мкг РНК, предварительно проведя обработку формамидом и формалином. РНК фиксировали, облучая мембрану в течение 10 мин УФ (254 нм) с интенсивностью 0.15 Дж/см2. Гибридизацию проводили 12 ч при 60° в 5Х SSC-буфере (75 мМ цитрат Na и 750 мМ NaCl, pH 7.0)
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.