ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2010, том 57, № 2, с. 280-286
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
СВЯЗЬ АЛЬТЕРНАТИВНОГО СПЛАЙСИНГА И НОНСЕНС-ОПОСРЕДОВАННОГО РАЗРУШЕНИЯ мРНК (NMD) В РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА THIC У АРАБИДОПСИСА © 2010 г. С. Ю. Маланин*,**, В. Ю. Никифорова****
*Институт молекулярной физиологии растений Общества Макса Планка, Потсдам, Германия **Казанский государственный университет, Казань ***Учреждение Российской академии наук Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва
Поступила в редакцию 04.06.2009 г.
Ген биосинтеза тиамина THIC у арабидопсиса (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.) кодирует две мРНК, образующиеся в результате альтернативного сплайсинга, соотношение которых регулируется изменяющейся концентрацией тиаминпирофосфата (ТПФ) в растении. Одна из образующихся сплай-синг-изоформ (THIC-III) подвержена быстрой деградации, что является основой для регуляции экспрессии этого гена. THIC-III характеризуется наличием длинного З'ИТЯ-конца, а также присутствием интрона в пре-мРНК на расстоянии более 55 нуклеотидов после стоп-кодона. Все это указывает на возможность деградации сплайсинг-изоформы THIC-III с помощью нонсенс-опосредованного разрушения мРНК (NMD). Целью работы была экспериментальная проверка этого предположения. Установлено, что для быстрой деградации THIC-III необходим процесс биосинтеза белка, т.е. трансляции. Кроме того, у мутантных растений с блокированным NMD тормозился процесс распада THIC-III и тем самым нарушалась обратная связь между эндогенной концентрацией ТПФ и экспрессией гена биосинтеза тиамина THIC. Все эти результаты свидетельствуют об участии NMD в разрушении транскрипта THIC-III и тем самым в регуляции экспрессии гена THIC. Таким образом, установлена связь процесса NMD с регуляцией экспрессии альтернативно сплайсируемо-го гена: при увеличении концентрации ТПФ в клетке и переключении альтернативного сплайсинга на образование изоформы THIC-III NMD принимает участие в ее деградации, тем самым уменьшая суммарную экспрессию гена THIC.
Ключевые слова: Arabidopsis thaliana — NMD — альтернативный сплайсинг — ТПФ
ВВЕДЕНИЕ
Регуляция экспрессии генов эукариот осуществляется разными способами как на уровне транскрипции, так и посттранскрипционно, и посттрансляционно. Все эти регуляторные процессы связаны между собой [1] и обеспечивают эффективную координацию активности клеток сложного организма, в том числе растительного.
Альтернативный сплайсинг является посттранскрипционным процессом, в результате которого экзоны пре-мРНК соединяются в различных комбинациях. Таким образом, один ген может кодировать две или несколько сплайсинг-изоформ мРНК, различающихся нуклеотидной последовательностью. В результате сравнения экспрессирующихся маркерных нуклеотидных
Сокращения: ПСК — преждевременный стоп-кодон; ТПФ — тиаминпирофосфат; NMD — нонсенс-опосредованное разрушение мРНК; 3'UTR — 3'-нетранслируемая область. Адрес для корреспонденции: Никифорова Виктория Юлиановна. 14476 Потсдам, Германия. Институт молекулярной физиологии растений Общества Макса Планка. Факс: 8-10-49-331-5678250; электронная почта: nikiforova@mpimp-golm.mpg.de
последовательностей (EST) с геномом арабидопсиса обнаружено, что около 20% генов растения подвергаются альтернативному сплайсингу [2], причем значительная часть образующихся изоформ является мишенью для механизма нонсенс-опосредованного разрушения мРНК (NMD от nonsense mediated decay), поскольку содержит так называемые преждевременные стоп-кодоны (ПСК). NMD — это система контроля качества транскриптов: мРНК с ПСК быстро разрушается в процессе трансляции, чтобы предотвратить синтез нефункциональных или вредных для клетки белков. Узнавание стоп-кодона как ПСК у эукариот происходит по разным критериям. В клетках млекопитающих стоп-кодон воспринимается как преждевременный (или нонсенс) стоп-кодон, если за ним до сплайсинга пре-мРНК следует интрон на расстоянии более 55 нуклеотидов (—55 boundary rule), в то время как у дрожжей необходимо наличие определенной нуклеотидной последовательности, находящейся после стоп-кодона [3]. Для растительных мРНК с ПСК характерным является наличие интронов в З'-некодирующей части
(3'UTR) пре-мРНК или длинной нуклеотидной последовательности между стоп-кодоном и по-лиА-"хвостом" [4].
Геном арабидопсиса содержит полный набор генов для биосинтеза тиамина и тиаминпирофос-фата (ТПФ, витамин Bj). Один из них — ген THIC (At2g29630), кодирующий белок, который принимает участие в синтезе пиримидиновой части витамина. Недавно было показано [5, 6], что экспрессия этого гена непосредственно регулируется ТПФ на посттранскрипционном уровне, при этом повышение концентрации ТПФ в растении приводит к альтернативному сплайсингу в 3'UTR транскрипта THIC, в результате которого образуются две сплайсинг-изоформы с различной стабильностью.
Ранее мы, как и авторы одной из работ [5], предположили, что NMD участвует в избирательной деградации одной из сплайсинг-изоформ мРНК THIC. Поэтому целью данного исследования являлось выяснение роли NMD в регуляции экспрессии гена THIC с участием механизма альтернативного сплайсинга. В результате работы впервые установлена связь этого механизма с нонсенс-опосредованным разрушением мРНК у растений.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растительный материал. Растения Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. дикого типа расы Columbia и мутантные растения, содержащие Т-ДНК вставку в гене UPF1 (At5g47010) (SALK_112922, "NASC", Англия), выращивали в почве при температуре 20/16°C день/ночь и 16-часовом фотопериоде. Суспензионную клеточную культуру арабидопси-са (расы Columbia), любезно предоставленную Dr. M. Pauly (Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology, Германия), выращивали в среде JPL [7] при еженедельном пассировании при температуре 20°С и постоянном освещении.
Обработка ингибиторами транскрипции и трансляции. 5-дневную суспензионную клеточную культуру арабидопсиса обрабатывали либо ингибитором транскрипции — кордицепином ("Sig-ma-Aldrich", США), либо кордицепином одновременно с ингибитором трансляции — цикло-гексимидом ("Calbiochem", США) в конечных концентрациях 150 мкг/мл для кордицепина и 10 мкг/мл для циклогексимида. По прошествии одного и трех часов после обработок растительный материал фиксировали в жидком азоте для последующего количественного измерения двух сплайсинг-изоформ THIC-II и THIC-III с помощью метода ПЦР в реальном времени (qRT-PCR).
Обработка растений тиамином. Пятинедельные растения дикого типа и мутантные растения обрабатывали путем опрыскивания листьев 1 мМ раствором тиамина ("Sigma-Aldrich") и водой в
качестве контроля. Через 72 ч после обработки растительный материал (листья) замораживали в жидком азоте и хранили при —80°С до последующего использования.
Измерение ТПФ с помощью ВЖЭХ. Экстракцию ТПФ из растительного материала (50 мг) проводили 0.1 М HCl (250 мкл) при температуре 100°С в течение 15 мин, после чего образцы центрифугировали в течение 3 мин при 10000 g. Для окисления витамина В1 до флуоресцирующего тиохрома использовали: 8.3 мкл 30 мМ K3Fe(CN)6, 50 мкл 1 М NaOH и 91.7 мкл метанола, которые добавляли в 100 мкл растительного экстракта.
Хроматографию проводили с помощью колонки Reprosil-Pur 120 NH2 ("Dr. Maisch HPLC GmbH", Германия). Измерения были выполнены с использованием инжектора Dionex ASI-100, насоса Dionex UltiMate 3000 и детектора Dionex RF 2000 Fluorescence Detector ("Dionex Corporation", США) со следующими параметрами: объем образца 10 мкл, скорость 1 мл/мин, длина волны возбуждения 375 нм, флуоресценции — 450 нм. Жидкой фазой служила смесь метанола и 0.1 М фосфатного буфера (рН 7.5) в соотношении 1.5 : 1.0. В качестве стандарта измеряли тиаминпирофосфат ("Sigma-Aldrich") в концентрациях 0, 0.1, 0.5, 1, 2, 4 мкМ. Анализ полученных данных проводили с помощью Chromeleon software ("Dionex Corporation").
Выделение РНК и синтез кДНК. Суммарную РНК выделяли из растительного материала с использованием реагента TRIZOL ("Invitrogen", Германия) в соответствии с протоколом производителя. Для синтеза кДНК использовали 1 мкг выделенной РНК, 60 нг праймера олиго-dT и 200 ед. обратной транскриптазы AccuScript ("Stratagene", США) в соответствии с протоколом производителя.
ПЦР в реальном времени (qRT-PCR). Уровень экспрессии транскриптов измеряли с использованием ПЦР в реальном времени. Реакция проходила в 384 луночной плашке в приборе 7900HT Fast Real-Time PCR System ("Applied Biosystems Inc.", США). В состав каждой реакции, конечный объем которой составлял 10 мкл, входили 1 нг кДНК, 200 нМ праймеров и 5 мкл 2х SYBR Green Master Mix reagent ("Applied Biosystems Inc."). Программа изменения температуры в ПЦР машине была следующей: 50°С 2 мин, 95°С 10 мин, 40 циклов при 95°С 15 с, 60°С 1 мин. Анализ данных проводили с помощью программы SDS 2.0 Software ("Applied Biosystems Inc."), для нормализации использовали значения экспрессии гена фактора элонгации eF1a (At5g60390). Нормализованный уровень экспрессии оценивали с помощью формулы: 40 - (аобразец - CteF1a), где 40 - общее количество циклов ПЦР, Ct — значение порогового цикла. Последовательности праймеров, использованных в работе, представлены в таблице.
Последовательности праймеров, использованных в qRT-PCR
Ген (транскрипт) Праймеры
прямой обратный
eFla tgagcacgctcttcttgctttca ggtggtggcatccatcttgttaca
UPF1 tcagggtctcccaaattcgc gattgctgtgggcctgaaag
THIC ctcaaggtgaactaactcgccg tggcccttcattcatcacctg
THIC-II tggactatacctggataaaggcaca tgactctgactcaaatgaacagacaac
THIC-III gaccaggctgagaaagtccctt actgcacactccctgcgc
На графиках приведены средние арифметические трех биологических повторностей и их стандартные ошибки.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Одна из сплайсинг-изоформ гена THIC может являться мишенью для NMD
Ген THIC арабидопсиса подвергается альтернативному сплайсингу 3'UTR-конца (рис. 1), в результате которого образуются две сплайсинг-изоформы, обладающие различной стабильностью [5, 6]. Нестабильная сплайсинг-изоформа THIC-III имеет более длинную нуклеотидную последовательность 3'UTR по сравнению с THIC-II. Кроме того, стоп-кодон
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.