ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 5, с. 721-731
УДК 581.1
СВЯЗЬ ГЕНА МАЛОГО ГТФ-СВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА С ЛОКУСОМ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ПРИЗНАКА УСТОЙЧИВОСТИ РИСА К ЗАТОПЛЕНИЮ
© 2004 г. В. Руаняйчон, Д. Сангракру, В. Камолсукьшньонг, М. Сианглив, Т. Тооджинда, С. Трагунрунг, А. Ванавичит
Университет Касетсарт, Камфенгсаен, Нахон Патом, Таиланд Поступила в редакцию 15.12.2002 г.
Малые ГТФ-связывающие белки участвуют в передаче сигналов в тканях млекопитающих и растений. В данной работе изменчивость первичного строения этих белков исследовали путем анализа фрагментов генома. Ранее был картирован, секвенирован и аннотирован 6.5-сМ участок хромосомы 9, соответствующий ведущему локусу количественного признака (QTL, от quantitative trait loci) устойчивости к затоплению. Длина одного из наиболее интересных генов-кандидатов этого QTL составляет 5.2 т.п.н. и включает кодирующую последовательность из двух экзонов и промотор. Производная аминокислотная последовательность 24.8-кД белка содержит 226 аминокислот и на 98% идентична RGP1, малому ГТФ-связывающему белку, участвующему в передаче сигнала в ответ на такие гормоны, как цитокинин и этилен. Судя по аминокислотной последовательности, предполагаемый белок относится к малым Ras-ГТФ-связывающим белкам. Судя по результатам ДНК-блот-анализа, ген, кодирующий этот белок, представлен в геноме риса единственной копией. Сравнение последовательностей этого гена в геномах нескольких форм риса, различающихся по устойчивости к затоплению, выявило однонуклеотидный полиморфизм (SNP, от single nucleotide polymorphism) в TATA последовательности промоторного участка Ras. Анализ сцепления показал, что предполагаемый ген ГТФ-связывающего белка ассоциирован с пиком QTL устойчивости к затоплению, картированного ранее на длинном плече хромосомы 9. Полиморфизм предполагаемого гена ГТФ-связы-вающего белка по конформации одноцепочечной ДНК (ssDNA от single strand DNA) можно использовать для различения аллелей и селекции на устойчивость к затоплению при помощи молекулярных маркеров.
Oryza sativa - Ras-GTP-связывающий белок - стресс затопления - полиморфизм по конформации одноцепочечной ДНК
Вызванный затоплением стресс снижает продуктивность риса в силу таких морфологических процессов, как удлинение и старение листьев и гибель всего растения [1]. Эти процессы тесно связаны с характерными изменениями в содержании отдельных фитогормонов, включая гиббереллин,
Сокращения: ПЦР - полимеразная цепная реакция; cM -сантиморганида; PAC - фаговая искусственная хромосома (от phage artificial chromosome); QTL - локус количественного признака (от quantitative trait locus); RGP1- ген Ras GTP-связывающего белка; RFLP - полиморфизм по длине рест-риктных фрагментов (от restriction fragment length polymorphism); SSCP - полиморфизм по конформации одноцепочечной ДНК (от single strand conformation polymorphism); ssDNA -одноцепочечная ДНК (от single strand DNA); UTR - нетранс-лируемый участок гена (от untranslated region). Адрес для корреспонденции: A. Vanavichit. Rice Gene Discovery, National Center for Genetic Engineering and Biotechnology, Kasetsart University, Kamphaengsaen, Nakhon Pathom 73140, P.O.Box 7, Thailand. Fax: 066-034-281-093; e-mail: apichart@dna.kps.ku.ac.th.
цитокинин и этилен. Благодаря таким физиологическим реакциям, как замедление растяжения клеток и задержка старения листьев, растения в состоянии преодолеть стресс, вызванный затоплением [2, 3]. Генетические исследования показали, что локусы, ответственные за устойчивость к затоплению, картируются в один и тот же участок хромосомы 9 [4, 5]. Поэтому исследования строения и функции соответствующих генов могут существенно способствовать пониманию генетических механизмов устойчивости риса к затоплению. Недавно был полностью секвенирован участок хромосомы 9, включающий ведущий QTL (локус количественного признака) устойчивости к затоплению. Полностью аннотированы более 30 кодирующих последовательностей, выделенных из семи искусственных фаговых хромосом (PAC, от phage artificial chromosome) и картированных на физической карте этого участка хромосомы 9. Один из генов устойчивости к затоплению, локализованный в этом участке гено-
ма, обнаружил сходство с геном RGP1, кодирующим один из Ras-подобных ГТФ-связывающих белков (G-белков) у риса Ginbozu [6]. Этот белок принадлежит к суперсемейству малых G-белков, участвующих в трансдукции сигналов [7]. В клетках млекопитающих Ras белки участвуют в активации каскада реакций совместно с активируемой митогеном протеинкиназой (МАП-киназой), первым элементом этого каскада служит Raf [8]. У растений малый G-белок выполняет важную роль в регуляции множества процессов в клетке, включая рост, дифференцировку и внутриклеточный транспорт [9].
Ранее Kameda с соавт. [10] показали, что генетическая модификация растений табака геном риса RGP1 в смысловой и антисмысловой ориен-тациях нарушает передачу сигнала, связанного с устойчивостью растений. Изменения фенотипа у растений табака, трансформированных геном риса RGP1, включали нарушение апикального доминирования, карликовость, нарушения в развитии цветков и повышенную устойчивость к вирусным и бактериальным болезням. Конститутивное накопление транскриптов RGP1 на всех этапах развития растений вызывало морфологические изменения у растений табака и риса, трансформированных геном риса RGP1 [11-13]. Хотя некоторые из морфологических изменений при затоплении были связаны с синтезом цитокининов, этот процесс не влиял на удлинение междоузлий [14]. Недавно Novikova с соавт. [15] обнаружили связь между малыми G-белками, реагирующим на этилен, и каскадом фосфорилирования белков в растениях гороха. Хотя биохимический механизм участия малых G-белков в трансдукции этиленового сигнала остается неисследованным, показано, что обработка корней кукурузы гуанозин-5'-у-тиотрифосфатом воспроизводила действие этилена на индукцию целлюлазы [16].
Чтобы селекция на устойчивость к затоплению была более быстрой и эффективной, используют молекулярные маркеры, в том числе полученные методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Новым методом идентификации и классификации нуклеотидных последовательностей является ПЦР-анализ полиморфизма по конформа-ции одноцепочечной ДНК (SSCP, от single strand conformation polymorphism) - наиболее чувствительный метод обнаружения изменений в геномной ДНК [17]. Этот метод позволяет обнаружить изменения в определенном участке одноцепочечной ДНК, связанные с вторичной структурой, при неденатурирующих условиях. Ранее SSCP маркеры уже использовали для генетического картирования риса [18].
Целью данного исследования было использование SSCP маркеров для идентификации и характеристики гена устойчивости к затоплению и
создание молекулярных маркеров, пригодных для селекции устойчивых к затоплению сортов риса. На основе гена Ras-подобного G-белка из PAC0645D04 риса Nipponbare (GenBank accession № AC090054) были сконструированы специфичные праймеры для SSCP анализа. Эти праймеры были использованы для амплификации геномной ДНК из различных сортов риса. В дальнейшем промоторный участок этого гена был использован в качестве специфичного маркера устойчивости риса к затоплению. В результате малый G-бе-лок был идентифицирован и ассоциирован с помощью молекулярных маркеров с геном устойчивости к затоплению SUB2.
МЕТОДИКА
Растительный материал. В работе использовали три сорта риса, устойчивых к затоплению: сорт FR13A из Индии, обнаруживающий исключительную устойчивость, сорт IR49830, полученный в Международном институте исследований риса, и DH206, Fl-производная дигаплоидная линия от скрещивания сорта FR13A с CT6241, неустойчивым к затоплению сортом из Международного центра тропического сельского хозяйства (CIAT). Неустойчивые к затоплению сорта включали KDML105 (традиционный сорт ароматного риса из Таиланда, важный в хозяйственном отношении, но чувствительный к затоплению), BT (черный рис, умеренно устойчивый к затоплению), CT6241 и Nipponbare (традиционный сорт из Японии). Пробы молодых листьев хранили при -80°C до экстракции ДНК при помощи CTAB (цетилтри-метил аммоний бромид)-№0 метода [19]. Для ПЦР-амплификации брали 50 нг геномной ДНК.
Компьютерный анализ последовательностей.
Для поиска кодирующих белки генов в составе клонированных в PAC фрагментов генома использовали blastX и blastn программы BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) и базы уникальных и экспрессируемых (expressed sequence tag, EST) последовательностей в генбанках NCBI (National Center for Biological Information) и TIGR (The International Genomic Research). При работе с программой BLAST по умолчанию использовали матрицу BLOSUM 62. Гомологию признавали достаточной при значении величины E выше e-15 и идентичности не менее 90% для отрезка длиной 250 нуклеотидов. Потенциальные кодирующие участки выявляли при помощи программ GenScan (Arabidopsis), GeneMark HMM (рис) и Grail (Arabi-dopsis) [20-22]. Производные аминокислотные последовательности сравнивали с соответствующей базой данных при помощи программы blastp [23]. Общие участки последовательностей выделяли при помощи программ Repeatmasker и tRNA Scan-SE (http://ftp.genome.washington.edu/RM/RepeatMasker.html [24]). Аннотацию генов проводили с учетом сте-
пени гомологии. Для анализа открытых рамок считывания (ORF, от open reading frame) использовали программы PROSITE, BLOCKs, ProDom, PRINTS и Plam (http://www.motife.genome.ad.jp) [25-29]. Для функционального анализа белков использовали Proteome analysis database (http://www. ebi.ac.uk/proteome/) и ExPASy Molecular Biology server (http://www.expasy.ch/).
Анилиз экcпpeccии гeнoв. Дифференциальную экспрессию генов в условиях затопления исследовали методом HUP обратной транскрипции (RT-PCR, от reverse transcription PCR), сравнивая общую PHK, выделенную из устойчивых к затоплению растений сорта FR13A после резкого затопления в полевых условиях в течение 2 сут, с общей PHK растений в нормальных условиях роста (контроль).
ДНК гeль-блoт яиялиз. Геномную 3,HK расщепляли полностью рестриктазами EcoRI и HindIII. Фрагменты ДH
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.