ОНТОГЕНЕЗ, 2004, том 35, № 6, с. 457-462
^=ФИЗИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ ^
УДК 577.175.32:612.621
СВЯЗЫВАНИЕ ПРОЛАКТИНА И СОМАТОТРОПИНА КЛЕТКАМИ ГРАНУЛЕЗЫ КОРОВ ПРИ ИХ РАЗНОМ РЕПРОДУКТИВНОМ СОСТОЯНИИ
© 2004 г. И. Ю. Лебедева, В. А. Лебедев, Т. И. Кузьмина
Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных
животных РАСХН 196625 Санкт-Петербург-Пушкин, Московское шоссе, д. 55а E-mail: irledv@mail.ru Поступила в редакцию 26.03.03 г.
Окончательный вариант получен 27.05.04 г.
Исследовано специфическое связывание бычьих пролактина и соматотропина клетками гранулезы из антральных фолликулов различного диаметра у коров, находящихся в разном репродуктивном состоянии: у половозрелых, неполовозрелых и на ранней стадии беременности. Способность клеток гранулезы к связыванию пролактина не зависит от репродуктивного статуса животных. В то же время динамика уровня специфического связывания соматотропина клетками гранулезы в процессе созревания антральных фолликулов различна при неодинаковом репродуктивном состоянии коров. При увеличении диаметра фолликулов от 3-5 до 6-10 мм у половозрелых коров специфическое связывание 1251-соматотропина клетками уменьшается, тогда как у неполовозрелых и беременных животных оно не изменяется. Анализ данных связывания по методу Скэтчарда показывает, что у коров половое созревание не влияет на параметры связывания пролактина и соматотропина клетками гранулезы из фолликулов диаметром 1-2 мм. Полученные данные свидетельствуют о том, что у коров снижение чувствительности гранулезных клеток к соматотропину на заключительных стадиях созревания антральных фолликулов, по-видимому, необходимо в развитии и приобретении последними способности овулировать.
Ключевые слова: пролактин, соматотропин, специфическое связывание, клетки гранулезы, фолликул, половая зрелость.
У коров вторая фаза созревания овариальных фолликулов, называемая также тоническим фол-ликулогенезом, характеризуется периодическим синхронным развитием группы антральных фолликулов диаметром 3-5 мм, один из которых становится доминантным и достигает наибольшего диаметра, подавляя при этом рост остальных ("субординатных") фолликулов (Driancourt, 1991; Fortune, 1994; Mihm, 2001). Периодический рост и последующая атрезия антральных фолликулов происходят как в фолликулярную, так и в люте-альную фазу эстрального цикла, однако только доминантный фолликул, появившийся во время регрессии желтого тела, становится овулятор-ным. Кроме того, синхронное развитие антральных фолликулов происходит в яичниках коров до половой зрелости и во время ранней беременности, причем при этих репродуктивных состояниях оно также носит волнообразный характер (Ginther et al., 1989; Adams et al., 1994). Тем не менее у неполовозрелых и беременных животных этот процесс имеет ряд особенностей, связанных в первую очередь с отсутствием овуляции доминантного фолликула, а также с некоторыми из-
менениями в динамике фолликулярного роста, обусловливающими уменьшение максимального диаметра доминантного фолликула. Так, рост ан-тральных фолликулов наблюдали у животных уже в возрасте 2 нед., однако первая овуляция происходила у них только через 53-56 нед. после рождения (Evans et al., 1994a, b). При этом максимальный диаметр доминантных фолликулов у 2-недельных животных был в два раза меньше, чем у коров с эстральным циклом (около 8.5 мм против 15-20 мм); по мере полового созревания он постепенно увеличивался до 13-14 мм (Evans et al., 1994a, b; Melvin et al., 1999). У беременных коров снижение максимального диаметра доминантных фолликулов по сравнению с половозрелыми животными было менее значительным (Ginther et al., 1989). Полагают, что основной причиной регрессии доминантных фолликулов, не приобретающих способности к овуляции, является пониженная частота импульсов лютеинизиру-ющего гормона (ЛГ), обусловленная повышенной концентрацией прогестерона у беременных коров или пониженной концентрацией эстрадио-ла у неполовозрелых животных (Mihm, 2001). Од-
нако не были в достаточной мере изучены факторы, связанные с отсутствием у доминантных фолликулов коров способности овулировать при этих репродуктивных состояниях.
За последние годы различные исследователи получили данные, свидетельствующие о вовлечении пролактина (ПРЛ) и соматотропного гормона (СТГ) в регуляцию тонического фолликулогене-за у млекопитающих, в том числе у коров (Bole-Feysot et al., 1998; Lebedeva et al., 1998; Hull, Harvey, 2001). Ранее нами были выявлены на клетках гра-нулезы коров низкоаффинные места связывания бычьих ПРЛ и СТГ, а также показано стимулирующее влияние этих гормонов на синтез ДНК в культуре этих клеток (Лебедева и др., 1994; 1995; 2001), что указывало на возможность участия ПРЛ и СТГ в регуляции роста антральных фолликулов. Кроме того, нами было обнаружено уменьшение числа мест связывания СТГ на клетках при увеличении диаметра антральных фолликулов коров от 3-5 до 6-10 мм и уменьшение числа мест связывания ПРЛ на клетках из фолликулов диаметром 11-20 мм (Лебедева и др., 2001). Эти данные позволяли предположить, что снижение чувствительности клеток гранулезы к СТГ и ПРЛ на завершающих стадиях фолликулярного созревания является необходимым событием в дифференцировке фолликулов перед овуляцией. С целью дальнейшего изучения возможной роли ПРЛ и СТГ в процессе приобретения фолликулами способности к овуляции провели сравнительное исследование уровней специфического связывания меченных 125I бычьих ПРЛ и СТГ клетками гранулезы из антральных фолликулов различного диаметра при разном репродуктивном состоянии коров: половозрелости, до половой зрелости и на ранней стадии беременности. Оценено также влияние полового созревания на параметры взаимодействия исследуемых гормонов с местами связывания на клетках гранулезы из фолликулов диаметром 1-2 мм.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Объектом исследования служили клетки гранулезы из антральных фолликулов яичников коров и 2-6-месячных неполовозрелых животных черно-пестрой породы (Bos taurus). В экспериментах использовали половозрелых коров, что подтверждалось наличием функционального или регрессирующего желтого тела в одном из яичников, а также коров на ранней стадии беременности (до 3 мес). Срок беременности оценивали на основании возрастных признаков эмбриона. Неполовозрелый статус животных подтверждался отсутствием желтых тел в обоих яичниках. В работе использовали полученные на мясокомбинате яичники без видимых признаков патологии, находящиеся на стадии фолликулярного роста и
рассасывающегося желтого тела. Клетки гранулезы получали путем аспирации содержимого фолликулов диаметром 1-2, 3-5 и 6-10 мм и последующего центрифугирования материала в течение 10 мин при 250 g. В образцах определяли долю клеток с пикнотическими ядрами в соответствии с методикой, описанной нами ранее (Лебедева и др., 1996). Для дальнейших исследований использовали суспензию клеток гранулезы с уровнем пикноза не более 30%. После удаления супернатанта клетки дважды промывали ресус-пендированием в инкубационном буфере следующего состава: 10 мМ mpuc-HCl (рН 7.1), 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, 5 мМ MgCl2, 0.2 мг/мл мертиолата и хранили при -20°C. Перед замораживанием конечную концентрацию клеток подсчитывали в гемоцитометре.
Изучение связывания 1251-СТГ и 1251-ПРЛ клетками гранулезы проводили стандартным методом, основанным на образовании комплекса меченый гормон-рецептор (Варфоломеев, Зайцев, 1982). В экспериментах использовали препараты гипофизарного бычьего ПРЛ (Институт эндокринологии, Москва) и рекомбинантного бычьего СТГ ("Monsanto", США), mpuc-HCl ("Reanal", Венгрия), [125I]Na ("Изотоп", Россия), а также бычий сывороточный альбумин, мертиолат и MgCl2 ("Sigma", США). Радиойодирование гормонов проводили модифицированным хлораминовым методом (Тараненко и др., 1975). Удельная активность составляла 0.6-1.2 МБк на 1 мкг СТГ или ПРЛ.
После размораживания при комнатной температуре клетки ресуспендировали в исходном буфере и центрифугировали в течение 30 мин при 2000 g (4°C), удаляли супернатант и добавляли свежий инкубационный буфер. Анализы связывания 1251-СТГ и 1251-ПРЛ клетками гранулезы проводили в соответствии с методикой, описанной нами ранее (Лебедева и др., 2001). Измерение радиоактивности проб и первичную обработку данных проводили на счетчике Compu-Gamma ("LKB", Швеция). Неспецифическое связывание меченых гормонов определяли в присутствии избытка соответствующих немеченых гормонов (250 мкг/мл). Уровень специфического связывания рассчитывали по разнице между общим и неспецифическим уровнями связывания и выражали как фемтомоли связанного меченого гормона на 106 клеток.
Кривые вытеснения получали при инкубации клеточной суспензии (1-2 х 106 клеток) с 1251-ПРЛ или 1251-СТГ (в фиксированной концентрации) в присутствии возрастающих концентраций немеченого ПРЛ (1.3-50 мкг/мл) или СТГ (2.575 мкг/мл). Константы диссоциации и количество мест связывания на клетках определяли путем обработки данных замещения с помощью графиче-
Рис. 1. Специфическое связывание 1251-ПРЛ (а) и 1251-СТГ (б) клетками гранулезы из антральных фолликулов различного диаметра при разном репродуктивном состоянии коров.
По оси абсцисс - диаметр фолликула, мм; по оси ординат - уровень специфического связывания меченых гормонов клетками гранулезы, фемтомоли на 106 клеток. Репродуктивное состояние: (Q) - поло-возрелость, (□) - до половой зрелости, (Щ ) - беременность. Число экспериментов n = 5; достоверные различия между сравниваемыми средними значениями: *,***p < 0.05; **,***p < 0.001; ***-****p < 0.05.
ского метода Скэтчарда (Scatchard, 1949). В этих экспериментах специфическое связывание клетками гранулезы составляло 11-14% от добавленного 1251-СТГ и 12-15% от добавленного 1251-ПРЛ.
Анализ каждого образца клеток проводили в трех параллельных пробах. Все эксперименты повторяли от трех до пяти раз. Данные обрабатывали методом дисперсионного анализа при помощи программы SigmaStat для Windows. Достоверность различия сравниваемых средних значений оценивали с использованием критерия Тью
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.